Combina la microscopia Intravital fluorescente (IVFM) con modelos genéticos para estudiar dinámica del Engraftment de células hematopoyéticas a nichos de la médula ósea

La microscopia intravital de fluorescencia multifotón (IVFM) es una técnica de imagen de gran alcance que permite la alta resolución y en tiempo real la proyección de imagen de tejidos con profundidad hasta 1mm, dependiendo del tejido. Cuando se aplica a la bóveda del ratón, permite observar el comportamiento de las células hematopoyéticas en el BM en una manera no invasiva hasta 60-100 μm¹¹. Aquí se utiliza este enfoque para determinar la cinética del engraftment de progenitores mieloides normales en los ratones knock-out de BM de RBPJ falta de señalización de Notch canónica.

Trabajos recientes de nuestro grupo demostraron defectuosa señalización canónica de muesca en el BM microambiente conduce a una Enfermedad mieloproliferativa como¹². Pérdida de la señalización de Notch se obtuvo por supresión condicional del dominio de unión de ADN de RBPJ, el factor de transcripción crítico aguas abajo de la muesca canónica de señalización, utilizando Mx1-Cre inducida por recombinación¹⁰. En este estudio, se utilizó el modelo de ratones de Mx1-Cre/RBPJ^lox/lox . Supresión condicional adorno DNA-obligatorio del RBPJ de resultados en la pérdida de la señalización de los receptores Notch. En el modelo Mx1-Cre Cre expresión es conducida por el promotor de Mx1 activado tras la administración de polyI:C dando por resultado la inducción específica de canceladura del gene en células de la sangre así como en componentes stromal de múltiples órganos, incluyendo el BM, el bazo y el hígado.

MX1-Cre⁺/RBPJ^lox/lox y Mx1-Cre^–/RBPJ^lox/lox ratones inducidos con polyI:C (aquí en adelante denominadas RBPJKO y RBPJWT, respectivamente) fueron irradiados letalmente y trasplantados con las células hematopoyéticas normales, tipo salvaje. A partir de la 4 semana después del trasplante, los receptores RBPJKO desarrollaron leucocitosis significativa seguido por esplenomegalia. Aunque ratones RBPJKO presentaron mayor porcentaje de progenitores mieloides en el BM en la semana 8 después del trasplante y en momentos más adelante, el análisis de BM en las semanas 4 y 6 no reveló diferencias llamativas en su contenido de células mieloides en comparación con el control RBPJWT destinatarios. Esta observación, junto con el hecho de que Cre Mx1 se expresa en diferentes órganos hematopoyéticos, planteó la cuestión de si el microambiente del BM tuvo impacto directo en la iniciación del fenotipo mieloproliferativo.

Para determinar si el BM era un sitio crítico inicial de desarrollo de la enfermedad, IVFM de la bóveda de ratón se usa en combinación con BM trasplante el modelo knock-out RBPJ y un sistema de seguimiento de linaje. Ratones transgénicos que expresaban EGFP bajo el control del promotor (Lys-GFP) lisozima específico⁹ fueron utilizados para obtener células de un donante que podrían visualizarse durante BM imagen después de BMT. Expresión de lisozima es específica de las células mieloides y Lys-GFP marca células del progenitor mieloide común (CMP) para los granulocitos maduros¹³.

IVFM del BM en diferentes puntos temporales demostró que las células GFP Lys alojados de manera similar a los destinatarios BM de RBPJWT y RBPJKO, pero ampliaron y engrafted rápidamente en los receptores de la BM de RBPJKO. Esta diferencia fue dramática en el momento anterior (semana 2) y disminuye con el tiempo (semanas 4 y 6). Sin embargo, en estos momentos más adelante, evaluación del compartimiento hematopoyético en el mismo recipiente demostró un aumento constante del número de células mieloides circulantes en la PB y localizados en el bazo de los ratones RBPJKO, lo que indica un aumento de la producción de células del BM en la circulación. Análisis de localización de células Lys-GFP en el BM de ratones trasplantados a las 6 semanas reveló que las células mieloides residían más lejos de la vasculatura en el microambiente de la RBPJKO que en el control.

Colectivamente, la combinación de IVFM con estos modelos animales específicos proporciona penetraciones en la dinámica del engraftment de células mieloides en el microambiente RBPJKO BM. El diseño experimental y el enfoque cuantitativo que se descrito aquí se propone como un paradigma que puede ser aplicado para hacer frente a preguntas similares. Por ejemplo, puede permitir el uso de otro linaje específico celular seguimiento de modelos, tales como GFP RAG1¹⁴ o Gata1-GFP¹⁵ ratones, siguiendo el comportamiento de linfoide o progenitores eritroides, respectivamente, en el BM.