Сочетая прижизненной флуоресцентной микроскопии (IVFM) с генетической модели для изучения динамики приживления кроветворных клеток костного мозга ниши

Прижизненные multiphoton флуоресцентной микроскопии (IVFM) – это мощный изображений метод, который позволяет с высоким разрешением в реальном времени визуализации тканей с глубиной до 1 мм, в зависимости от ткани. При применении к calvarium мыши, позволяет наблюдения за поведением гемопоэтических клеток в BM неинвазивным способом до 60-100 мкм¹¹. Этот подход используется здесь для определения кинетика приживления нормальной миелоидного прародителями мышей нокаут-БМ RBPJ, не хватает канонические Notch сигнализации.

Последние работы из нашей группы продемонстрировали, что дефектных канонические Notch сигнализации в BM микроокружения приводит к болезни миелопролиферативных как¹². Потеря Notch сигнализации был получен условного удаления ДНК привязки домена RBPJ, критических транскрипционный фактор, вниз по течению канонических выемки, сигнализации, используя Mx1-Cre индуцированной рекомбинации¹⁰. В этом исследовании была использована модель мыши^{аргона/lox} Mx1-Cre/RBPJ. Условного удаления ДНК связывающих мотив RBPJ приводит к потере сигнализации от всех Notch рецепторов. В модели Mx1-Cre, КРР, выражение управляется промоутер Mx1, активируется после отправления polyI:C, что приводит к индукции удаления целевых генов в клетки крови, а также стромальные компонентов нескольких органов, в том числе BM, селезенки и печени.

Mx1-Cre⁺/RBPJ^{жидкий кислород/lox} и мышей^{аргона/lox} Mx1-Cre^–/RBPJ индуцированных с polyI:C (расписка указано как RBPJKO и RBPJWT, соответственно) были смертельно облученных и пересадить с нормальной, дикого типа гемопоэтических клеток. Начиная с 4 недели после пересадки, RBPJKO получателей разработали значительное лейкоцитоза, следуют спленомегалия. Хотя RBPJKO мышей представил увеличение доли миелоидного прародителями БМ на неделе 8 после пересадки и позднее момента времени, анализ БМ на 4 и 6 недель не выявить различия в их содержание миелоидных клеток, по сравнению с контролем RBPJWT получателей. Это наблюдение, а также тот факт, что Mx1-Cre выражается в различных кроветворных органов, возникает вопрос, ли BM микроокружения имел непосредственное влияние на возбуждение миелопролиферативных фенотип.

Чтобы определить, является ли BM критическим местом первоначального развития болезни, IVFM мыши calvarium был использован в сочетании с BM трансплантации (БМТ), нокаут-модель RBPJ и линии, системы слежения. Трансгенных мышей, выражая EGFP под контролем конкретных лизоцима промоутер (Lys-GFP)⁹ были использованы для получения клеток донора, которые могут быть визуализированы в BM изображений после ТКМ. Лизоцим выражение для миелоидных клеток и Lys-GFP знаменует клетки от общей миелоидного progenitor (CMP) до зрелых гранулоцитов¹³.

IVFM BM в разное время точках продемонстрировали, что Lys-GFP клетки указаны аналогичным получателям БМ RBPJWT и RBPJKO, но расширена и быстрее прижившимися, в БМ RBPJKO получателей. Эта разница была резко на предшествующий момент времени (2 недели) и со временем (недели 4 и 6). Однако в этих более поздних точках времени, оценки гемопоэтических отсека в же получателю показал устойчивый рост числа миелоидных клеток, циркулирующих в PB и локализованы в селезенке RBPJKO мышей, показывающее увеличение производства клеток от БМ в кровоток. Анализ Lys-GFP клетки локализации в BM пересаженных мышей на 6 недель показали, что миелоидных клеток проживало дальше сосудистую в RBPJKO микроокружения чем в элементе управления.

Коллективно сочетание IVFM с этих конкретных животных моделей позволило получить информацию в динамике приживления миелоидных клеток в RBPJKO BM микроокружения. Экспериментальный дизайн и количественный подход, описанный здесь предлагается в качестве парадигмы, которые могут применяться для решения подобных вопросов. Например, может разрешить использование других клеток конкретных линии отслеживания модели, такие как RAG1-GFP¹⁴ или¹⁵ мышей Gata1-GFP, после поведение лимфоидной или эритроидные предшественники, соответственно, в BM.