Intravital Fluorescent microscopie (IVFM) te combineren met genetische modellen om te studeren van Engraftment dynamiek van hematopoietische cellen aan het beenmerg Niches

Intravital multiphoton fluorescentie microscopie (IVFM) is een krachtige beeldvormende techniek waarmee de hoge resolutie, real-time imaging van weefsels met diepte tot 1mm, afhankelijk van het weefsel. Wanneer toegepast op de calvarium van de muis, laat het observeren van het gedrag van de hematopoietische cellen binnen de BM in een niet-invasieve manier omhoog tot en met 60-100 μm¹¹. Deze benadering wordt hier gebruikt om te bepalen van de kinetiek van de engraftment van normale myeloïde voorlopercellen in de BM van RBPJ knock-out muizen ontbreekt canonieke Notch signalering.

Recente werk van onze fractie aangetoond dat defecte canonieke Notch signalering in de BM communicatie leidt tot een myeloproliferatieve-achtige ziekte¹². Verlies van Inkeping signalering werd verkregen door voorwaardelijke schrapping van het DNA-bindende domein van RBPJ, de kritische transcriptiefactor stroomafwaarts van canonieke uitsparing signalering, met behulp van de Mx1-Cre geïnduceerde recombinatie¹⁰. In deze studie werd de Mx1-Cre/RBPJ^lox/lox muizen model gebruikt. Voorwaardelijke schrapping van het DNA-bindende motief van RBPJ leidt tot het verlies van signalering van alle Notch receptoren. In het model van de Mx1-Cre, Cre expressie wordt gedreven door de promotor van de Mx1 geactiveerd bij toediening van polyI:C, resulterend in de inductie van verwijdering van de gerichte gen in cellen van het bloed zo goed zoals in stromale onderdelen van meerdere organen, met inbegrip van BM, de milt en de lever.

Mx1-Cre⁺/RBPJ^lox/lox en Mx1-Cre^–/RBPJ^lox/lox muizen geïnduceerde met polyI:C (visualisering aangegeven als RBPJKO en RBPJWT, respectievelijk) dodelijk waren bestraald en met normale, wild type hematopoietische cellen getransplanteerd. Vanaf week 4 na de transplantatie, ontwikkeld RBPJKO ontvangers belangrijke leukocytose gevolgd door splenomegalie. Hoewel RBPJKO muizen gepresenteerd verhoogd percentage van myeloïde voorlopercellen in de BM tijdens week 8 na de transplantatie en op latere tijdstippen, openbaarde analyse van BM op weken 4 en 6 niet opvallende verschillen in hun myeloïde celinhoud in vergelijking met controle RBPJWT ontvangers. Deze observatie, samen met het feit dat de Mx1-Cre wordt uitgedrukt in verschillende hematopoietische organen, de vraag gesteld of de BM communicatie directe invloed gehad op de opening van het myeloproliferatieve fenotype.

Om te bepalen of de BM een kritieke eerste site van ziekte ontwikkeling was, werd IVFM van de muis calvarium gebruikt in combinatie met BM transplantatie (BMT), het model van de knock-out RBPJ, en een tracking systeem afkomst. Transgene muizen EGFP uiten onder de controle van de specifieke lysozym promotor (Lys-GFP)⁹ werden gebruikt om het verkrijgen van de donor cellen die tijdens BM imaging na BMT kon worden gevisualiseerd. Lysozym expressie is specifiek voor myeloïde cellen en Lys-GFP markeert cellen van de gemeenschappelijke myeloïde voorlopercellen (CMP) voor de volwassen granulocyt-¹³.

IVFM van de BM op verschillende tijdstippen aangetoond dat Lys-GFP cellen homed op dezelfde manier naar de geadresseerden BM van RBPJWT en RBPJKO, maar uitgebreid en sneller geaccepteerd in de BM van RBPJKO ontvangers. Dit verschil was dramatisch op het eerdere tijdstip (week 2) en daalde na verloop van tijd (weken 4 en 6). Echter bij deze latere tijdstippen, evaluatie van het hematopoietische compartiment in de dezelfde ontvanger toonde een gestage toename in het aantal myeloïde cellen circuleren in de PB en gelokaliseerd in de milt van RBPJKO muizen, met vermelding van een verhoogde productie van cellen van de BM in de circulatie. Onderzoek van Lys-GFP cellen lokalisatie in het BM van getransplanteerde muizen op 6 weken bleek dat myeloïde cellen verder van de therapieën in de communicatie van de RBPJKO dan in het besturingselement woonden.

Collectief, de combinatie van IVFM met deze specifieke diermodellen geboden inzichten in de dynamiek van de engraftment van myeloïde cellen in de RBPJKO BM-communicatie. De proefopzet en kwantitatieve benadering hier beschreven wordt voorgesteld als een paradigma die kan worden toegepast om soortgelijke vragen. Bijvoorbeeld, kunnen het gebruik van andere cel specifieke afstamming bijhouden van modellen, zoals RAG1-GFP¹⁴ of Gata1-GFP¹⁵ muizen, naar aanleiding van het gedrag van lymfoïde of erythroid progenitorcellen, respectievelijk in de BM.