Seguimiento de preparación y 3D de dispositivos catalíticos de natación

PRECAUCIÓN: Por favor, consulte a todas las hojas de datos de seguridad de materiales pertinentes antes de su uso. El peróxido de hidrógeno se usa en este protocolo es perjudicial, y la evolución de gas de oxígeno cuando se expone al platino plantea un riesgo de explosión. Use todos los controles de seguridad adecuados durante este protocolo, incluidos los controles de ingeniería durante la manipulación de soluciones de peróxido (campana de humos) y equipo de protección personal (gafas de seguridad, guantes y bata de laboratorio). 1. Hacer catalítica Janus Partículas Prepare el substrato de lámina de vidrio Limpiar un portaobjetos de microscopio estándar no utilizado en el lavado secuencial durante unos minutos cada uno en agua desionizada (DI), solución de descontaminación vidrio y el agua DI. A continuación, lavar con un 70:30 v: v mezcla de etanol: agua DI, y finalmente secar en una corriente de aire / nitrógeno limpio. Examine el portaobjetos de vidrio bajo un microscopio para verificar que la superficie esté limpia y libre de evidencia de contaminación por partículas. Repita el paso 1.1.1 si es necesario. Preparar dispersión coloidal para la deposición Pipeta de 10 l de solución acuosa de coloides de Stock fluorescente (10% en peso.) En 990 l de etanol. Ajustar los volúmenes según sea necesario en función de la concentración de la solución madre utilizada para llegar a 0,1% en peso aproximadamente suspensión coloidal. mezcla de vórtice durante 10 segundos. Capa de la vuelta dispersión coloidal sobre el sustrato portaobjetos de vidrio Equipar una recubridora de rotación con el portaobjetos de vidrio limpio. Llenar una punta de pipeta con 100 l de la solución coloidal diluida preparada anteriormente. revestidor programa de centrifugado para ejecutar un 30 seg, 2.000 rpm ciclo. Iniciar la recubridora de rotación, y cuando a la velocidad pipetear de forma continua la solución preparada en el centro de la placa de vidrio de hilatura. Retire portaobjetos de vidrio de la recubridora de rotación, volver al microscopio óptico y verificar que una dispersión uniforme de los coloides separados sobre todo que no se tocan cubre la región central of el portaobjetos de vidrio. Se evaporan al vacío de metal platino sobre coloide portaobjetos de vidrio decorado Insertar el portaobjetos de vidrio recubierto de coloide en un evaporador de metal. Asegúrese de que el coloide decorado lado se enfrenta a la fuente de evaporación. Instalar una fuente de evaporación de metal platino y depositar 15 nm de platino metálico. Nota: Después de la deposición de metal, las muestras deben almacenarse en una atmósfera inerte. 2. "Natación" partículas Janus Volver a suspender Janus Coloides en una solución que contiene peróxido Cortar un cuadrado de 1 x 1 cm de tejido del cristalino, y amortiguar el final con 10 l de agua DI. Mantenga con pinzas, y frotar suavemente a lo largo de la superficie del coloide decorado portaobjetos de vidrio recubierto de platino (este paso elimina físicamente los coloides del sustrato). Inserte el tejido objetivo en 1,5 ml de agua desionizada y agitar manualmente vigorosamente durante 30 segundos en un tu selladaser. Eliminar el tejido objetivo. Pipeta de 1 ml de la solución coloidal en un nuevo envase que contiene, llenos de 1 ml de 30% w / v H solución madre 2 O 2. Mezclar suavemente las soluciones, y luego se coloca en un baño ultrasónico a temperatura ambiente durante 5 min, seguido de otro periodo de incubación de 25 minutos sin agitación. PRECAUCIÓN: Esta solución puede evolucionar de oxígeno; no selle. Seco de 100 l de la solución coloidal acuosa restante en un microscopio electrónico de barrido (SEM) de código auxiliar para permitir la verificación SEM de la estructura de coloide Janus. 14 Preparar cubeta de análisis Añadir un adicional de 1 ml de agua DI a la solución incubada que contiene coloides de peróxido y de platino recubierto de llegar a una fuerza de combustible adecuado (10%) para permitir la propulsión rápido. Nota: Las etapas de incubación anteriores se llevaron a cabo en concentraciones de combustible concentración más alta para limpiar la superficie del catalizador de platino. Llenar un lovolumen w cubeta de vidrio de cuarzo rectangular con la solución incubada. entrar holgadamente una tapa de empuje hacia dentro. PRECAUCIÓN: Riesgo de explosión – no utilice un tapón de rosca. 3. Observación Microscópica Localiza partícula de interés Cargar la cubeta en un microscopio de fluorescencia equipado con un objetivo adecuado (por ejemplo, 20X) y excitar emisión de fluoróforo utilizando una combinación adecuada de filtros (excitación 450 a 490 nm, emisión> 515 nm). buscar manualmente los coloides fluorescentes dentro de la cubeta. Nota: Ajuste de la densidad coloide mientras se mantiene la concentración de peróxido puede ser requerida. Por ejemplo, se recomienda la dilución si la densidad coloidal es alta, y numerosas burbujas de oxígeno que producen flujos están presentes. Una concentración en volumen de coloides de aproximadamente 0,003% es un punto de partida recomendado. Optimizar la configuración óptica para un seguimiento 3D: en condiciones de iluminación adecuadas, in centrarse coloides aparecerá objetos circulares como afilados. Sin embargo, como la propulsión mueve los coloides en y fuera del plano focal de un tamaño distintivo cambio de anillo brillante centrada alrededor de la esfera se observará, esto se utiliza para determinar la coordenada z para permitir el seguimiento 3D. Grabar video Antes de iniciar la captura de vídeo, enfocar el microscopio de modo que la partícula de interés produce un anillo concéntrico, con la partícula "en" la posición de enfoque. No mueva el plano de enfoque durante la captura de vídeo. Grabar videos de partículas de interés. Usar duraciones de vídeos 30 seg con velocidades de cuadro por encima de 30 Hz para permitir la reconstrucción detallada trayectoria. Reconstrucción de la trayectoria 3D Calibre del eje z Hacer un peso de 2%. solución de goma gellan en agua que contiene una suspensión de partículas Janus fluorescentes a 60 ° C, en lugar de una cubeta equivalente ala utilizada anteriormente, y dejar solidificar para formar una muestra gelificado transparente rígido que contiene coloides estáticos fijos. Centrarse en un único coloide fija usando las mismas condiciones de iluminación seleccionados anteriormente, ahora grabar una serie de imágenes fijas como el Z-foco se eleva por los desplazamientos conocidos relativos a este plano. Determinar el radio del anillo en cada posición de enfoque conocido 11. Nota: Este es todavía más eficiente realizado mediante el uso de un algoritmo de análisis de imágenes que se puede aplicar como un proceso por lotes para toda la calibración marcos, y videos. Un enfoque típico implica suavizar la imagen, de umbral para identificar una ubicación aproximada del centro de los objetos ', y después la localización de los x reales y las coordenadas Y del centro del anillo mediante la medición de la distancia entre picos de intensidad a cada lado del anillo. La distancia radial media de los picos de intensidad del centro del anillo a continuación se puede encontrar. 11 Esto permite que tanto el radio de la brillante un anillod coordenada que se determine con precisión sub-pixel xy. Por la localización de la x, y, z de posición de una esfera Janus fija en la goma gellan 30 micras desde el plano focal, en una secuencia de tiempo de las imágenes, las partículas pueden estar situados con un error de ± 25 nm a lo largo de cada eje. El error se puede atribuir a ruido en las imágenes. La relación señal a ruido y por lo tanto, la exactitud de los algoritmos de localización depende de la intensidad de la luz de fluorescencia detectada. Cuando una esfera Janus está lejos del plano focal su intensidad se vuelve demasiado débil para rastrear con precisión que, por ejemplo, para un diámetro de 4,8 micras coloide un z-gama de alrededor de 200 micras es posible. Un método no algorítmica alternativa es usar la medición manual sencillo de x, y centro y el radio, sin embargo, esto reducirá la precisión. Trazar una curva de calibración para relacionar el radio de z-posición y complete a una función apropiada (por ejemplo, la ecuación cúbica) para permitir la interpolación. 11 <li> Calibrar x, eje y Grabar una imagen fija imagen de microscopio óptico de una retícula de calibración espacial utilizando las mismas condiciones de microscopio elegidos en el punto 3.2. Medir la dimensión "en píxeles" de un objeto cuando se conoce el tamaño real de la imagen de la retícula de calibración espacial y usar esto para establecer un factor de conversión a píxeles micras para el plano x, y de la imagen. reconstruir la trayectoria Determinar las coordenadas x e y y radio para cada trama de la secuencia de vídeo como se describe en 3.3.1.3, utilice la función que se encuentra en 3.3.1.4 para convertir radio en z, y el factor de calibración se encuentra en 3.3.2.2 para convertir x e y coordenadas de píxeles en micras. Este procedimiento resultará en un precisos x, y, z de coordenadas para la ubicación partículas de propulsión como una función de tiempo. 11 Este procedimiento se puede implementar utilizando un algoritmo, o de forma manual. Determinar la derivada propiedades como la velocidad promedio para cuantificar la magnitud de la natación catalítica observada.