Подготовка и 3D Tracking каталитических Плавательные устройств

ВНИМАНИЕ: Пожалуйста, обратитесь все соответствующие паспорта безопасности материала перед использованием. Перекись водорода используется в данном протоколе является вредным, а эволюция газообразного кислорода при воздействии на платину создает опасность взрыва. Используйте все соответствующие меры контроля безопасности во время этого протокола, включая технические средства контроля при обращении растворов пероксида (вытяжной шкаф) и средства индивидуальной защиты (защитные очки, перчатки и лабораторный халат). 1. Создание каталитического Janus Частицы Приготовьте стеклянную подложку слайд Очистите неиспользуемый стандартного микроскопа с использованием последовательного промывку в течение нескольких минут каждый в деионизованной (ДИ) воды, стекла обеззараживание раствором и дистиллированной воды. Затем промыть водой с 70:30 обоб смеси этанола: ДИ воды, и, наконец, высушите в потоке чистого воздуха / азота. Осмотрите предметное стекло под микроскопом, чтобы проверить, чтобы поверхность была чистой и свободной от доказательств загрязнения твердыми частицами. Повторите шаг 1.1.1, если требуется. Подготовить коллоидную дисперсию для осаждения Внесите 10 мкл водного раствора коллоидного запас люминесцентная (10 мас.%) В 990 мкл этанола. Отрегулируйте объемы по мере необходимости в зависимости от концентрации исходного раствора, используемого, чтобы достигнуть примерно 0,1% мас коллоидной суспензии. Вихревой смесь в течение 10 сек. Спин слой коллоидной дисперсии на подложку из стекла слайд Одета спиновый станок с чистой предметное стекло. Заполните наконечник пипетки с 100 мкл разбавленного коллоидного раствора, приготовленного выше. спин Программа для нанесения покрытий выполнить 30 сек, 2000 оборотов в минуту цикла. Запуск отжима устройства для нанесения покрытия, и, когда до скорости непрерывно пипеткой приготовленный раствор на центр центробежно предметное стекло. Удалите предметное стекло от спина нанесения покрытий, вернуться в оптический микроскоп и убедитесь, что даже дисперсия в основном не соприкасающихся отдельных коллоидов охватывает центральную область Oе на предметное стекло. Вакуумная испаряются металл платиновой группы на коллоидной украшены стекло Вставьте коллоидный покрытием предметное стекло в металлический испаритель. Убедитесь, что коллоид декорированный сторона обращена к источнику испарения. Установить источник испарения платины металла и осаждают 15 нм металлической платины. Примечание: После осаждения металла, пробы должны храниться в инертной атмосфере. 2. "Плавательные" Янус Частицы Повторное приостановить Janus коллоидов в раствор , содержащий перекись Вырезать 1 х 1 см площади линзы ткани и смочите конец с 10 мкл деионизированной воды. Удерживая пинцетом, и аккуратно протереть вдоль поверхности платины с покрытием коллоидной декорированный предметное стекло (этот шаг физически удаляет коллоиды от подложки). Вставьте ткань объектива в 1,5 мл дистиллированной воды и вручную энергично встряхивают в течение 30 секунд в герметичном Tuбыть. Удалить объектив ткани. Пипетка 1 мл коллоида , содержащего раствор в новый контейнер, заполненный 1 мл 30% вес / об H 2 O 2 маточного раствора. Аккуратно перемешать растворы, а затем поместить в ультразвуковой ванне при комнатной температуре в течение 5 мин, а затем еще на 25-минутного периода инкубации без перемешивания. ВНИМАНИЕ: Это решение может развиваться кислород; не печать. Сухие 100 мкл оставшегося водного раствора коллоидного на сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) заглушке для того, чтобы SEM проверки структуры коллоидной Janus. 14 Подготовить анализ кювету Добавить дополнительно 1 мл дистиллированной воды к инкубируемого раствора, содержащего перекись, и платиновые покрытием коллоиды, чтобы прийти к соответствующей прочности топлива (10%), чтобы обеспечить быстрое двигательной установки. Примечание: предыдущие стадии инкубации проводили в более высоких концентрациях концентрация топлива для очистки поверхности платинового катализатора. Заполните лож объем прямоугольной формы из кварцевого стекла кювету с раствором инкубированных. Неплотно соответствовать Быстроразьемное колпачок. ВНИМАНИЕ: Опасность взрыва – не используйте винтовую крышку. 3. Микроскопическое наблюдение Найдите частицу интереса Нагрузка кювету в флуоресцентный микроскоп , снабженный подходящей цели (например, 20Х) и возбуждают излучение флуорофора с использованием подходящей комбинации фильтров (возбуждения 450-490 нм, эмиссия> 515 нм). Ручной поиск люминесцентных коллоидов внутри кювете. Примечание: Регулировка плотности коллоидный при поддержании концентрации пероксида может потребоваться. Например, разбавление рекомендуется, если коллоид плотность высока, и многочисленные пузырьки кислорода, продуцирующие потоки присутствуют. Концентрация Объем коллоидный около 0,003% является рекомендуемой отправной точкой. Оптимизация оптических параметров для 3D-слежения: при подходящих условиях освещения, яп фокус коллоидов будет выглядеть как острые круглые объекты. Однако, как двигательная перемещает коллоидов и из фокальной плоскости отличительный размер меняется яркое кольцо, сосредоточенный вокруг области будет наблюдаться, это используется для определения координат г, чтобы включить 3D-слежение. Запись видео Перед началом захвата видео, фокус микроскопа так, что частица интерес вызывает концентрическое кольцо, с частицей "под" положением фокуса. Не двигайся фокальную плоскость во время захвата видео. Запись видео частиц, представляющих интерес. Используйте 30 сек видео продолжительность с частотой кадров превышает 30 Гц, чтобы разрешить детальную реконструкцию траектории. Реконструкция 3D траектории Калибровка Z-оси Составляют 2% мас. геллановая раствор камеди в воде, содержащей суспензию флуоресцентных частиц Януса при 60 ° С, помещают в эквивалентной кювету длячто использовали выше, и позволяют установить, чтобы сформировать жесткую прозрачную гелеобразной образец, содержащий фиксированные статические коллоиды. Фокус на одной фиксированной коллоида с использованием тех же условий освещенности, выбранные выше, в настоящее время записи серии неподвижных изображений в виде Z-фокуса возбуждается известных смещений относительно этой плоскости. Определить радиус кольца на каждом известном положении фокусировки 11. Примечание: Это наиболее эффективно осуществляется с использованием алгоритма анализа изображений, который может быть применен в качестве периодического процесса, чтобы все калибровки отдельных кадров, и видео. Типичный подход предполагает сглаживание изображения, пороговая, чтобы определить приблизительное местоположение центра объектов, а затем местонахождение действительных х и у координаты центра кольца путем измерения расстояния между пиками интенсивности обе стороны от кольца. Среднее радиальное расстояние до пиков интенсивности от центра кольца , то можно найти. 11 Это позволяет , и радиус яркому кольцомd ху координат определяется с субпиксельной точностью. При размещении х, у, г положение сферы Януса закрепленной в геллановой камеди 30 мкм от фокальной плоскости, во временной последовательности изображений, частицы могут быть расположены с погрешностью ± 25 нм вдоль каждой оси. Ошибка может быть связано с шумом в изображениях. Соотношение сигнал-шум и, следовательно, точность определения местоположения алгоритмов зависит от интенсивности обнаруженного света флуоресценции. Когда сфера Janus находится далеко от фокальной плоскости его интенсивность становится слишком слабым , чтобы точно отслеживать его, например, для диаметра 4,8 мкм коллоидного Z-диапазон около 200 мкм возможно. Альтернативный неалгоритмические метод заключается в использовании простого ручного измерения х, у центра и радиус, однако это приводит к снижению точности. Участок калибровочной кривой , соотносить радиус г- м положении, и подходят к соответствующей функции (например, кубическое уравнение) , чтобы позволить интерполяции. 11 <литий> Калибровать х, у оси Запись статичный кадр оптического микроскопа изображение пространственной калибровки сетки с использованием тех же условий микроскопа, выбранных в 3.2. Мера "в пикселях" размер объекта с известным размером реального мира с изображением пространственной калибровки и сетки использовать эту функцию, чтобы установить пикселей на коэффициент преобразования микрона для х, у плоскости изображения. Реконструировать траекторию Определить координаты х и у и радиус для каждого кадра видеопоследовательности, как описано в 3.3.1.3, используйте функцию найденное в 3.3.1.4 для преобразования радиуса в г, а коэффициент калибровки найденный в 3.3.2.2 для преобразования х и у пиксельные координаты в микронах. Эта процедура приводит к точному х, у, г координата расположения пропульсивной частиц в виде функции от времени. 11 Эта процедура может быть реализована с использованием алгоритма, или вручную. Определение производной рЕ СВОЙСТВА, такие как средняя скорость для количественной оценки степени наблюдаемого каталитического плавания.