Preparação e 3D Rastreamento de Catalytic Natação Devices

ATENÇÃO: Por favor, consulte todas as fichas de dados de segurança do material relevantes antes do uso. O peróxido de hidrogênio utilizado neste protocolo é prejudicial, e a evolução de gás de oxigênio quando exposto à platina representa um risco de explosão. Use todos os controles de segurança apropriados durante este protocolo, incluindo controles de engenharia ao manusear soluções de peróxido (extractor de fumo) e equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, luvas e bata de laboratório). 1. Fazendo Catalytic Janus partículas Prepare substrato lâmina de vidro Limpar uma lâmina de microscópio padrão não utilizado, usando a lavagem sequencial por alguns minutos cada, em água deionizada (DI) de água, solução de descontaminação de vidro e água DI. Em seguida, lave com um 70:30 v: v mistura de etanol: água DI e, finalmente, golpe seco em uma corrente de ar / nitrogênio limpo. Examine a lâmina de vidro sob um microscópio para verificar a superfície esteja limpa e livre de evidência de contaminação por partículas. Repita o passo 1.1.1, se necessário. Prepare dispersão coloidal para deposição Pipetar 10 ul de solução aquosa de colóide estoque fluorescente (10% em peso.) Em 990 ul de etanol. Ajuste volumes conforme necessário, dependendo da concentração da solução estoque utilizado para chegar a cerca de suspensão peso coloidal 0,1%. mistura de vórtice durante 10 seg. Revestimento de spin dispersão coloidal em substrato lâmina de vidro Equipar um revestidor de rotação com a lâmina de vidro limpa. Encha com uma ponta de pipeta 100 uL da solução diluída coloidal preparada acima. rotação programa para executar um revestidor de 30 s, ciclo 2000 rpm. Iniciar revestidor de rotação, e quando uma velocidade continuamente até a solução preparada pipeta para o centro da lâmina de vidro de fiação. Remover lâmina de vidro do coater rotação, retornar ao microscópio óptico e verificar se uma dispersão uniforme de colóides separadas principalmente não tocar cobre a região o centrof a lâmina de vidro. Vacuum evaporar metal platina em colóide decorados lâmina de vidro Inserir a lâmina de vidro coloidal revestido de metal para um evaporador. Verifique se o colóide decorados lado está voltado para a fonte de evaporação. Instalar uma fonte de evaporação de metal de platina e o depósito de 15 nm de platina metálica. Nota: Após a deposição de metal, as amostras devem ser armazenadas sob uma atmosfera inerte. 2. "Natação" partículas Janus Re-suspender Janus Colloids numa solução contendo peróxido Corte um 1 x 1 centímetro quadrado do tecido da lente, e amortecer a extremidade com 10 ul de água desionizada. Segurar com uma pinça, e esfregar suavemente ao longo da superfície da lâmina de vidro decorados colóide de platina revestido (Este passo remove fisicamente colóides do substrato). Insira o tecido lenticular, em 1,5 ml de água DI e agitar manualmente vigorosamente por 30 segundos num tu seladaestar. Remover o tecido da lente. Pipete 1 mL de solução contendo o colóide para um novo recipiente, cheios com 1 ml de 30% w / v solução de H 2 O 2. Misturar suavemente as soluções, e, em seguida, colocar num banho de ultra-sons à temperatura ambiente durante 5 min, seguido por um outro período de incubação de 25 minutos sem agitação. ATENÇÃO: Esta solução pode evoluir de oxigênio; Não selar. Secas 100 ul da solução coloidal aquosa restante em um microscópio eletrônico de varredura (SEM) stub para permitir a verificação SEM da estrutura coloidal Janus 14. Prepare cuvette análise Adicionar um adicional de 1 ml de água desionizada para a solução incubada contendo colóides de peróxido e de platina revestido de chegar a uma força de combustível adequada (10%) para permitir a propulsão rápida. Nota: As etapas de incubação anteriores foram realizados em concentrações mais elevadas de combustível concentração para limpar a superfície do catalisador de platina. Encha a lovolume de w de quartzo retangular tina de vidro com a solução incubada. Vagamente encaixar uma tampa push-in. CUIDADO: Risco de explosão – não use uma tampa de rosca. 3. microscópica Observação Localizar partícula de interesse Carregar a cuvete um microscópio de fluorescência equipado com uma objectiva adequado (por exemplo, 20X) e excita emissão fluoróforo utilizando uma combinação adequada de filtros (excitação 450-490 nm, emissão a> 515 nm). procurar manualmente colóides fluorescentes dentro da tina. Nota: Ajustar a densidade colóide, mantendo a concentração de peróxido pode ser necessária. Por exemplo, a diluição é recomendado se a densidade colóide é alta, e numerosas bolhas de oxigénio que produzem fluxos estão presentes. A concentração em volume do colóide de cerca de 0,003% é um ponto de partida recomendada. Otimizar as configurações ópticas para rastreamento 3D: em condições de iluminação adequadas, iN concentrar colóides aparece objectos circulares como afiadas. No entanto, como os coloides de propulsão se move dentro e para fora do plano focal um tamanho distinto mudando anel brilhante centrada em torno da esfera será observado, este é utilizado para determinar a coordenada z para activar o controlo de 3D. Gravar vídeo Antes de iniciar a captação de vídeo, o foco do microscópio de modo a que a partícula de interesse produz um anel concêntrico, com a partícula "sob" a posição do foco. Não mova o plano de foco durante a captura de vídeo. Gravar vídeos de partículas de interesse. Use durações de vídeo de 30 segundos com taxas de quadro superiores a 30 Hz para permitir a reconstrução trajetória detalhada. Reconstrução trajetória 3D Calibrar eixo z Faça-se um peso de 2%. solução de goma de gelana em água que contém uma suspensão de partículas de Janus fluorescentes a 60 ° C, em lugar de uma cuvete equivalente aque é utilizado acima, e deixar solidificar para formar uma amostra de gel transparente rígida contendo colóides estáticos fixos. Concentre-se em um único colóide fixo usando as mesmas condições de iluminação selecionados acima, agora gravar uma série de imagens estáticas como o foco z é levantada por deslocamentos conhecidos relativos a este plano. Determinar o raio do anel em cada posição de focagem conhecido 11. Nota: Este é ainda mais eficiente realizada por meio de um algoritmo de análise de imagem que pode ser aplicado como um processo em lotes para todos os quadros de calibração, e vídeos. Uma abordagem típica envolve suavizar a imagem, limiar para identificar uma localização aproximada do centro dos objetos e, em seguida, localizar os x reais e y coordenadas do centro do anel, medindo a distância entre os picos de intensidade de ambos os lados do anel. A distância radial significativo para os picos de intensidade do centro do anel pode então ser encontrado. 11 Esta permite que o raio do um anel brilhanted xy coordenar a serem determinadas com precisão sub-pixel. Ao localizar o X, Y, Z posição de uma esfera Janus fixo em goma de gelano de 30 um em relação ao plano focal, numa sequência temporal das imagens, as partículas podem ser localizados com um erro de ± 25 nm ao longo de cada eixo. O erro pode ser atribuída a ruído nas imagens. A relação sinal-ruído e, por conseguinte, a precisão dos algoritmos de localização é dependente da intensidade da luz de fluorescência detectado. Quando uma esfera Janus é medida a partir do plano focal sua intensidade torna-se muito fraca para controlar com precisão o que, por exemplo, para um diâmetro de 4,8 | iM colóide um z-gama de cerca de 200 um é possível. Um método não-algorítmica alternativa é a utilização de medição manual simples de x, y e o centro do raio, no entanto, isto vai reduzir a precisão. Traçar uma curva de calibração para relacionar raio para z-position, e apto para uma função apropriada (por exemplo, equação, cúbico) para permitir a interpolação. 11 <li> Calibrar x, eixo y Gravar um ainda armação imagem do microscópio óptico de uma retícula de calibração espacial usando as mesmas condições de microscópio escolhido no ponto 3.2. Medir a dimensão "em pixels" de um objeto com dimensões conhecidas do mundo real a partir da imagem da retícula calibração espacial e usar isso para estabelecer um pixels para fator de conversão micron para o x, y plano da imagem. reconstruir a trajetória Determine as coordenadas x e y e raio para cada quadro da sequência de vídeo como descrito em 3.3.1.3, use a função encontrada em 3.3.1.4 para converter raio em z, eo fator de calibração encontrado em 3.3.2.2 para converter x e y coordenadas de pixel em microns. Este processo resultará num precisos x, y, z coordenadas para o local de partículas de propulsão como uma função do tempo. 11 Este processo pode ser implementado utilizando um algoritmo, ou manualmente. Determinar o p derivadaROPRIEDADES tais como velocidade média para quantificar a extensão da natação catalítica observada.