触媒水泳デバイスの作製と3Dトラッキング

注意：使用する前に、関連するすべての物質安全データシートを参照してください。このプロトコルで使用される過酸化水素は有害であり、白金に暴露された酸素ガスの発生は、爆発の危険をもたらします。過酸化物溶液（ヒュームフード）と個人用保護具（安全眼鏡、手袋、白衣）を処理しながら、技術管理など、このプロトコル中にすべての適切な安全管理を使用してください。 1.触媒ヤヌス粒子を製造します スライドガラス基板を準備 脱イオン（DI）水、ガラス除染液とDI水で数分間ずつ、順次洗浄を使用して、未使用の標準的な顕微鏡スライドを清掃してください。エタノールのV混合物：その後70:30 Vで洗浄し、DI水、そして最後にきれいな空気/窒素気流中で乾燥吹きます。 表面は粒子汚染の証拠からきれい、自由であることを確認するために、顕微鏡下でスライドガラスを調べます。繰り返し手順1.1。1必要に応じて。 堆積のためのコロイド分散液を準備します ピペットのエタノール990μlのに水性株価蛍光コロイド溶液（10重量％）の10μlの。約0.1％の重量のコロイド懸濁液に到着するために使用される原液の濃度に応じて、必要に応じてボリュームを調整します。 10秒間ボルテックスミックス。 スライドガラス基板上にスピンコートコロイド分散 きれいなガラススライドでスピンコーターを装備。上記調製した希釈コロイド溶液の100μlをピペットチップを埋めます。 30秒間、2000回転サイクルを実行するためのプログラムスピンコーター。スピンコーターを起動し、アップが高速化するときに連続して回転スライドガラスの中央上に調製した溶液をピペット。 、スピンコーターからスライドガラスを取り外し、光学顕微鏡に戻り、主に非触​​れる別々のコロイドの均一な分散が中央領域Oをカバーしていることを確認スライドガラスF。 真空コロイド装飾されたガラススライド上に白金金属を蒸発させます 金属蒸発器にコロイドコーティングされたガラススライドを挿入します。コロイド装飾された側が蒸発源に直面していることを確認します。白金金属蒸着源と白金金属の堆積物は15nmをインストールします。 注意：金属蒸着後、サンプルは、不活性雰囲気下で保存する必要があります。 2.「水泳」ヤヌス粒子 過酸化物を含む溶液にヤヌスコロイドを再懸濁 レンズ組織の1×1cm角にカットし、DI水の10μlの終了を減衰させます。ピンセットで保持し、静かに（このステップは、物理的に基板からコロイドを削除）プラチナコーティングされたコロイド飾らスライドガラスの表面に沿ってこします。 DI水1.5ミリリットルにレンズティッシュを挿入し、手動で密封されたTUで30秒間激しく振りますです。レンズ組織を削除します。 ピペットV H 2 O 2のストック溶液/ W1 30mlのの％が充填された新たな容器に溶液を含有するコロイド1mlを、。静かに溶液を混合し、その後さらに25分間攪拌しない潜伏期間に続いて5分間、室温で超音波浴中に置きます。 注意：このソリューションは、酸素を進化させることができます。密封しないでください。 残りの水性コロイド溶液の乾燥100μlのヤヌスコロイド構造のSEMの検証を可能にするために、走査型電子顕微鏡（SEM）スタブ上に14 分析キュベットを準備 高速の推進を可能にするために、適切な燃料強（10％）に到達するために過酸化物と白金被覆されたコロイドを含むインキュベーション溶液に、DI水の追加の1ミリリットルを追加します。 注意：インキュベーション前のステージは、白金触媒の表面を洗浄するために高濃度燃料の濃度で行いました。 loの塗りつぶしインキュベーション溶液でワットボリューム長方形の石英ガラスキュベット。緩くプッシュインキャップを取付け。 注意：爆発の危険 – スクリューキャップを使用しないでください。 3.顕微鏡観察 関心の粒子の位置を確認します ロード適切な目的（ 例えば、20X）を装備した蛍光顕微鏡へのキュベットおよび適切なフィルタの組み合わせ（励起450〜490 nmの発光> 515 nm）を用いた蛍光体の発光を励起します。 手動でキュベット内の蛍光コロイドを検索します。 注：過酸化物濃度を維持しながら、コロイド密度の調整が必要とされ得ます。例えば、コロイド濃度が高い場合には希釈が推奨され、およびフローを生成する多数の酸素の気泡​​が存在しています。約0.003％のコロイド体積濃度は、推奨出発点です。 3Dトラッキングのための光学設定を最適化：適切な照明条件の下で、私はnはコロイドは鋭い円形のオブジェクトとして表示されます焦点を当てます。推進球を中心明るいリングを変更する独特の大きさと焦点面からコロイドを移動するが、これは、zは3次元トラッキングを可能にするように調整するかを決定するために使用され、観察されます。 録画映像 興味の粒子が焦点位置」の「粒子と、同心のリングを生成するようにビデオキャプチャを開始する前に、顕微鏡の焦点を合わせます。ビデオキャプチャ時の焦点面を移動しないでください。 関心の粒子の録画ビデオ。詳細な軌道再構成を可能にするために30ヘルツを超えるフレームレートで30秒の映像期間を使用します。 3D軌道再建 z軸をキャリブレーション 2％の重量を占めています。 60°Cに相当キュベット内の場所での蛍光ヤヌス粒子の懸濁液を含む水におけるジェランガム溶液それは、上記の使用、および固定静的コロイドを含む硬い透明なゲル状のサンプルを形成するように設定することができます。 上記選択したのと同じ照明条件を用いて、単一の固定コロイドに焦点を当て、今、この面に対して既知の変位によって発生するZ-フォーカスなどの一連の静止画像を記録します。 既知の各焦点位置11でリングの半径を決定します。 注：これは、静止フレーム、ビデオ最も効率的に実行されたすべてのキャリブレーションにバッチ処理として適用することができる画像解析アルゴリズムを使用することです。典型的なアプローチは、オブジェクトの中心のおおよその位置を識別するために画像、閾値を平滑化し、次いで、強度ピークのいずれかの環の面との間の距離を測定することにより、リングの中心の実際のx、y座標の位置を含みます。リングの中心から強度ピークまでの平均半径方向距離は、その後見つけることができます。11これは明るいリングANの半径の両方を可能にしますD XYは、サブピクセル精度で決定される座標。焦点面からジェランガム固定ヤヌス球30μmのX、Y、Z位置を特定することによって、画像の時系列的に、粒子は、各軸に沿って±25nmの誤差で配置することができます。エラーは、画像のノイズに起因することができます。信号対雑音比、したがっては、位置アルゴリズムの精度は、検出された蛍光光の強度に依存します。ヤヌス球が遠い焦点面から、その強度は、例えば 、それを正確に追跡するために弱くなりすぎている場合、4.8μmの直径のコロイドのために約200ミクロンのz範囲が可能です。代替の非アルゴリズム的方法は、x、yの中心と半径の単純な手動測定を使用することですが、これは精度が低下します。 z位置に半径を関連付けるために較正曲線をプロットし、補間を可能にするために、適切な機能（ 例えば 、三次方程式）に適合します。11 <李> 校正のx、yの軸 まだ3.2で選択した同じ顕微鏡条件を用いて空間較正の目盛りの光学顕微鏡像をフレーム記録します。 空間較正の目盛りの画像から既知の実世界のサイズを持つオブジェクトの「ピクセル」寸法を測定し、X、Y画像平面のためのミクロン変換係数にピクセルを確立するためにこれを使用しています。 軌道を再構築 3.3.1.3に記載されているようにx、yを変換するために、Zに半径を変換するために3.3.1.4に見出される機能、および3.3.2.2に見られる較正係数を使用して、ビデオシーケンスの各フレームのx、y座標および半径を決定しますピクセルは、ミクロンに調整します。この手順は、時間の関数としての推進粒子の位置座標に正確なX、Y、Zをもたらすであろう。11この手順は、アルゴリズムを使用して実装、または手動ですることができます。 派生Pを決定しますこのような観測された触媒水泳の程度を定量化するための平均速度としてroperties。