Generación e identificación de GM-CSF Derivado alveolares-como los macrófagos y las células dendríticas A partir de médula ósea de ratones

Varios métodos de cultivo in vitro se han descrito para generar macrófagos de médula derivadas de médula (BMDMs) y las DC derivadas de médula ósea (BMDCs) utilizando uno o una combinación de factores de crecimiento. BMDMs se puede generar mediante el cultivo de células de médula ósea usando factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) o GM-CSF ^1,2. Para BMDCs, la adición de ligando FLT3 para el cultivo de médula ósea da lugar a DCs plasmacitoides clásicos y no adherentes (CD11c ^alta MHCII ^alta y CD11c ^lo /, B220 ^+, respectivamente) después de 9 días en cultivo ^3,4. En contraste, las células no adherentes generan después de 7 a 10 días en cultivo con GM-CSF solo ^5,6, GM-CSF e IL-4 ^7, o GM-CSF y FLT3 ligando ^8,9 generan BMDCs se parece más a los países en desarrollo inflamatorias ^(alta CD11c, CD11b ⁺ MHCII ^{alta) 10.} Si bien se utilizan estos cultivos in vitro para generar los macrófagos oLos países en desarrollo, no está claro si cada cultura da lugar a poblaciones puras. Por ejemplo, aunque se describen las células adherentes en los cultivos GM-CSF para ser macrófagos ^5, las células no adherentes de la misma cultura se utilizan como los DC ^6,11-13, con la presunción de que son homogéneos y cualquier variabilidad observada es debido a las diferentes etapas de desarrollo ^14,15. Además, los estudios han encontrado GM-CSF para ser un factor de crecimiento esencial para el desarrollo de los macrófagos alveolares in vivo ^16,17, y se pueden utilizar in vitro para generar los macrófagos alveolares como ^16,17,18.

Aparte de la adhesión, los procedimientos para la generación de los macrófagos y los países en desarrollo de cultivos de médula ósea tratados con GM-CSF son muy similares sugiriendo heterogeneidad puede existir dentro de cultivos de médula ósea de GM-CSF. De hecho, esto parece ser el caso como dos documentos informan de la presencia de BMDMs en la fracción no adherente de las culturas BMDC. En uno de papel, que identified una población de células como CD11c ^+, CD11b ^+, MHCII ^mediados, MerTK ⁺ y CD115 ^+, que expresa una expresión genética que se parecía más estrechamente los macrófagos alveolares y tenía una capacidad reducida para activar las células T ^19. El segundo papel utilizado MHCII y FL-HA para identificar una población de macrófagos alveolares similar (CD11c ^+, MHCII ^{media / baja,} FL-HA ^{de alto)} que era distinta de inmaduros (CD11c ^+, MHCII ^mediados, FL-HA ^baja) y madura DC (CD11c ^+, MHCII ^alta), tanto fenotípicamente y funcionalmente ^18. Estos documentos ilustran que ambos cultivos GM-CSF BMDC son heterogéneos, que contiene tanto los macrófagos y DC poblaciones que indica que se debe tener cuidado al interpretar los datos a partir de cultivos de BMDC.

Este protocolo describe cómo aislar de la médula ósea, células de médula ósea en cultivo GM-CSF, e identificar el alveolar similar a macrófagospoblación de los países en desarrollo inmaduro y maduros en el cultivo de médula ósea mediante citometría de flujo utilizando la unión y la expresión MHCII FL-HA. Este procedimiento se basa en el procedimiento establecido de Lutz et al ⁶ y es capaz de generar. 5 – 10 x 10 ⁶ células no adherentes en el día 7 de un cultivo de 10 ml. El cultivo se puede utilizar desde días 7 a 10 y se obtiene una población heterogénea de macrófagos, células dendríticas inmaduras y maduras, así como algunos progenitores en el día 7. Esto proporciona un método simple para crecer y aislar in vitro macrófagos alveolares-como en grandes cantidades.