Génération et identification de GM-CSF dérivé alvéolaires comme Macrophages et cellules dendritiques à partir de moelle osseuse de souris

Plusieurs méthodes de culture in vitro ont été décrits pour générer des macrophages d'os dérivées de la moelle (BMDMs) et les CD dérivées de la moelle osseuse (BMDC) en utilisant un ou une combinaison de facteurs de croissance. BMDMs peut être produite en cultivant des cellules de moelle osseuse en utilisant soit le facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF) ou le GM-CSF ^1,2. Pour BMDCs, l'addition d' un ligand de FLT3 dans la culture de moelle osseuse donne lieu à des DC plasmacytoïdes classiques et non-adhérentes (CD11c ^haut / MHCII ^haut et CD11c ^lo, B220 ⁺ , respectivement) après 9 jours de culture , ^3,4. En revanche, les cellules non adhérentes générées après 7 à 10 jours de culture avec GM-CSF seul ^5,6, GM-CSF et l' IL-4 ^7, ou le GM-CSF et FLT3 ligand ^8,9 génèrent BMDCs ressemblant davantage les PED inflammatoires (CD11c ^haute, MHCII ^haute CD11b ^{+) 10.} Bien que ces cultures in vitro sont utilisées pour générer des macrophages ouDC, il est difficile de savoir si chaque culture donne lieu à des populations pures. Par exemple, bien que les cellules adhérentes dans les cultures GM-CSF sont décrits comme les macrophages ^5, les cellules non-adhérentes de la même culture sont utilisés comme DC ^6,11-13, avec la présomption qu'ils sont homogènes et toute variabilité observée est en raison de différents stades de développement ^14,15. En outre, des études ont montré GM-CSF d'être un facteur de croissance essentiel pour le développement des macrophages alvéolaires in vivo ^16,17, et peuvent être utilisés in vitro pour générer alvéolaires comme les macrophages ^16,17,18.

Autre que l'adhésion, les procédures de génération des macrophages et des pays en développement à partir de cultures de moelle osseuse GM-CSF traités sont très similaires suggérant l'hétérogénéité peuvent exister au sein des cultures de moelle osseuse GM-CSF. Cela semble bien être le cas que deux documents font état de la présence de BMDMs dans la fraction non adhérente des cultures BMDC. Dans un papier, ils identified une population de cellules que CD11c ^+, CD11b ^+, MHCII ^mi, MerTK ⁺ et CD115 ^+, qui exprimait une signature d'expression génique qui ressemblait plus étroitement les macrophages alvéolaires et avait une capacité réduite à activer les cellules T ^19. Le second papier utilisé MHCII et FL-HA pour identifier une population de type macrophage alvéolaire (CD11c ^+, MHCII ^{mid / low,} FL-HA ^élevé) qui était distincte de immature (CD11c ^+, MHCII ^mi, FL-HA ^bas) et mature DC (CD11c ^+, MHCII ^haute), à la fois phénotypiquement et fonctionnellement ^18. Ces documents illustrent les deux que les cultures GM-CSF BMDC sont hétérogènes, contenant à la fois des macrophages et des populations DC indiquant que les soins doivent être prises lors de l'interprétation des données à partir de cultures BMDC.

Ce protocole décrit comment isoler la moelle osseuse, des cellules de moelle osseuse dans la culture de GM-CSF, et d'identifier les alvéoles macrophagepopulation à partir des CD immatures et matures dans la culture de la moelle osseuse par cytométrie en flux en utilisant la liaison et l'expression MHCII FL-HA. Cette procédure est basée sur la procédure établie de Lutz et al ⁶ et est capable de générer. 5 – 10 x 10 ⁶ cellules non adhérentes au jour 7 de la culture de 10 ml. La culture est utilisable de jours 7 à 10 et on obtient une population hétérogène de macrophages, DCs immatures et matures, ainsi que des progéniteurs au jour 7. Ceci permet d' obtenir une méthode simple pour isoler et cultiver in vitro des macrophages alvéolaires analogues dans de grandes quantités.