Генерация и идентификация GM-CSF производный альвеол, как макрофаги и дендритные клетки из костного мозга мыши

Существует несколько методов культурах клеток, были описаны для генерации из костного мозга макрофаги (BMDMs) и из костного мозга (DCS BMDCs) с использованием одного или комбинации факторов роста. BMDMs могут быть получены путем культивирования клеток костного мозга с использованием либо макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF) или GM-CSF ^1,2. Для BMDCs, добавление лиганда FLT3 к культуре костного мозга приводит к неприлипающими классических и плазмоцитов ГЦ (CD11c ^{высокий} / MHCII ^{высокий} и CD11c ^Lo, B220 ⁺ соответственно) через 9 дней в культуре ^3,4. В отличие от этого , не прилипшие клетки генерироваться после 7 до 10 дней в культуре с использованием только GM-CSF ^5,6, GM-CSF , и IL-4 , ^7, или GM-CSF , и FLT3 лиганд ^8,9 генерировать BMDCs более близко напоминающих воспалительные DCs (CD11c ^{высокий, высокий} MHCII CD11b ^{+) 10.} В то время как эти культуры в пробирке используются для создания макрофаги илиКонтроллеры домена, неясно, если каждая культура порождает чистых популяций. Например, хотя прилипшие клетки в GM-CSF культур описаны как макрофаги ^5, неадгезивные клетки из той же самой культуры используются в качестве контроллеров домена ^6,11-13, с предположения , что они являются однородными и любых наблюдаемых изменчивость из – за различных этапах развития ^14,15. Кроме того, исследования показали , GM-CSF , чтобы стать существенным фактором роста для развития альвеолярных макрофагов в естественных условиях ^16,17, и может быть использовано в пробирке для генерации альвеолярных типа макрофаги ^16,17,18.

Кроме соблюдения, процедуры генерации макрофаги и контроллеры домена с GM-CSF, обработанных культурах костного мозга очень похожи предполагает гетерогенность может существовать в GM-CSF культурах костного мозга. Это на самом деле, кажется, так, как две газеты сообщают о присутствии BMDMs в неприлипающими фракции BMDC культур. В одном документе, они Опознавательнаяред популяция клеток как CD11c ^+, CD11b ^+, MHCII ^{середине,} MerTK ⁺ и CD115 ^+, выразившего экспрессии генов подписи , который наиболее близко напоминающее альвеолярные макрофаги и имели пониженную способность активировать Т – клетки ^19. Второй документ используется MHCII и FL-HA для идентификации альвеолярного макрофага типа населения (CD11c ^+, MHCII ^{средний / низкий,} FL-HA ^{высокий)} , который был отличен от незрелых (CD11c ^+, MHCII ^{середина,} FL-HA ^{низкий)} и пожилые РС (CD11c ^+, MHCII ^{высокий),} как фенотипически и функционально ^18. Эти документы показывают, что оба GM-CSF BMDC культуры являются гетерогенными, содержащие как макрофаги и популяции DC, указывающего, что следует проявлять осторожность при интерпретации данных из BMDC культур.

Этот протокол описывает, как изолировать костный мозг, клетки мозга кости в культуре GM-CSF, а также определить альвеолярного микрофагоподобныхнаселение от незрелых и зрелых ДК в культуре костного мозга с помощью проточной цитометрии с использованием связывания и экспрессию MHCII FL-HA. Эта процедура основана на установленном порядке Лутц и др ⁶ и способен генерировать . 5 – 10 х 10 ⁶ неприкрепленных клеток на 7 -й день в 10 мл культуры. Культура может использоваться от 7 дней до 10 и дает гетерогенную популяцию макрофагов, незрелых и зрелых ДК, а также некоторых клеток – предшественников на 7. Это обеспечивает простой способ , чтобы расти и изолировать в пробирке альвеолярно-как макрофаги в больших количествах день.