Kinetische Messung und Echtzeit-Visualisierung von Somatic Reprogrammierung

Patienten stammende induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) sind vielversprechende Werkzeuge für Zelltherapie und Wirkstoff-Screening. Sie bieten eine autologe Quelle von Zellen für die Therapie. Darüber hinaus umfassen sie ein sehr breites Spektrum an genetischen Hintergründen, eine detaillierte In – vitro – Analyse von genetischen Erkrankungen jenseits dessen, was Strom an embryonalen Stammzellen (ESC) Linien erlauben würde , zu ermöglichen. Jüngste Fortschritte haben zur Entwicklung verschiedener Methoden geführt iPSCs zur Erzeugung, einschließlich Umprogrammierung mit Sendai – Virus, episomalen Plasmiden oder mRNAs ^1,2. Bemerkenswerterweise sind verschiedene Verfahren der Reprogrammierung zugeordnet Ebenen der Effizienz und Sicherheit Variation und sind wahrscheinlich auf andere Weise zu unterscheiden, die ihre Eignung für verschiedene Anwendungen beeinflussen. Mit der Verfügbarkeit von einer Vielzahl von Umprogrammierung Technologien hat es wichtig geworden, Methoden zu entwickeln, um die Reprogrammierung zu bewerten. Die meisten existierenden Verfahren stützen sich auf die qualitative Kontrolle der Morphologie oder Färbungmit Stammzell-spezifische Farbstoffe und Antikörper. Eine kürzlich entwickelte Methode nutzt lentiviralen Fluoreszenz – Reporter , die empfindlich auf PSC-spezifischen miRNAs oder differenzierte zellspezifischen mRNAs ^3. Eine solche Überwachungsmethoden, die Auswahl und Optimierung der Reprogrammierung Techniken für unterschiedliche Situationen erleichtern. Zum Beispiel wurde als fluoreszierende Sonde für frühe iPSCs um zu screenen für Umprogrammierung Modulatoren ⁴ CDY1 verwendet. Die Fähigkeit, zu beobachten und verschiedene Umprogrammierung Experimente vergleichen ist auch entscheidend für sich ein besseres Verständnis des Verfahrens zu gewinnen. Zum Beispiel ist es nun bekannt , dass einige somatische Zelltypen leichter sind als andere umprogrammieren ^5, und dass die Zellen gehen durch Zwischenzustände während ^6-8 Neuprogrammierung. Leider sind die Mechanismen, die die Reprogrammierung Verfahren zugrundeliegenden noch nicht vollständig verstanden und folglich bleiben die genauen Unterschiede zwischen Umprogrammierung Methoden auch als defined. So Methoden zur Überwachung, Bewertung und Neuprogrammierung Ereignisse Vergleich weiterhin für die Stammzell-Feld kritisch zu sein.

Die Verfahren in diesem Protokoll beschrieben ermöglichen die Überwachung und Beurteilung der Umprogrammierung und zeigen, wie diese Techniken verwendet werden können, verschiedene Sätze von Umprogrammierung Reagenzien zu vergleichen. Der erste Ansatz beinhaltet Durchflusszytometrie analysiert Kombinationen von Antikörpern gegen positive und negative pluripotenten Stammzellen (PSC) Marker. Der zweite Ansatz Paare Echtzeit-Bildgebung und die Messung der Gesamt Einmündung (die Fläche Prozent Oberfläche durch die Zellen bedeckt) und Einmündung der Markierungssignale (Bereich Prozent Oberfläche durch die fluoreszierenden Signale abgedeckt).