Summary

Кинетическая измерения и в реальном времени Визуализация соматического Перепрограммирование

Published: July 30, 2016
doi:

Summary

Протокол, представленные в данном исследовании, описаны способы мониторинга в реальном времени прогрессии перепрограммирования через кинетический измерения положительных и отрицательных маркеров плюрипотентных стволовых клеток с использованием проточной цитометрии. Протокол также включает в себя оценку формирования изображения на основе морфологии и маркер или экспрессии репортера во время генерации иПСК.

Abstract

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease phenotypes. Recent advances have identified more efficient and safe methods for introduction of reprogramming factors. However, there are few tools to monitor and track the progression of reprogramming. Current methods for monitoring reprogramming rely on the qualitative inspection of morphology or staining with stem cell-specific dyes and antibodies. Tools to dissect the progression of iPSC generation can help better understand the process under different conditions from diverse cell sources.

This study presents key approaches for kinetic measurement of reprogramming progression using flow cytometry as well as real-time monitoring via imaging. To measure the kinetics of reprogramming, flow analysis was performed at discrete time points using antibodies against positive and negative pluripotent stem cell markers. The combination of real-time visualization and flow analysis enables the quantitative study of reprogramming at different stages and provides a more accurate comparison of different systems and methods. Real-time, image-based analysis was used for the continuous monitoring of fibroblasts as they are reprogrammed in a feeder-free medium system. The kinetics of colony formation was measured based on confluence in the phase contrast or fluorescence channels after staining with live alkaline phosphatase dye or antibodies against SSEA4 or TRA-1-60. The results indicated that measurement of confluence provides semi-quantitative metrics to monitor the progression of reprogramming.

Introduction

Пациент полученные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) являются перспективными инструментами для клеточной терапии и скрининга лекарств. Они обеспечивают аутологичной источник клеток для терапии. Кроме того, они охватывают очень широкий набор генетического происхождения, что позволяет детальный анализ в пробирке генетических заболеваний за то , что в настоящее время эмбриональных стволовых клеток (ESC) линии позволили бы. Последние достижения привели к разработке нескольких методов генерации ИПСК, включая перепрограммирование с вирусом Сендай, эписомная плазмид или мРНК в 1,2 раза . Следует отметить, что различные методы перепрограммирования связаны с различными уровнями эффективности и безопасности, а также, вероятно, отличаются другими способами, которые влияют на их пригодность для различных областей применения. При наличии множества перепрограммирования технологий, стало важно разработать методы для оценки процесса перепрограммирования. Большинство существующих методов полагаются на качественной проверке морфологии или окрашиванияс сотовыми специфических красителей стволовых и антител. Один недавно разработанный метод использует лентивирусов репортеров флуоресценции, которые чувствительны к PSC конкретных микроРНК или дифференцированных клеток специфических мРНК 3. Такие методы мониторинга облегчают выбор и оптимизация методов перепрограммирования для различных ситуаций. Например, CDy1 был использован в качестве флуоресцентного зонда для ранних ИПСК для того , чтобы на экране для перепрограммирования модуляторов 4. Способность наблюдать и сравнивать различные эксперименты на перепрограммирование также имеет важное значение для достижения лучшего понимания самого процесса. Например, в настоящее время известно , что некоторые типы клеток соматические легче перепрограммировать , чем другие 5, и что клетки проходят через промежуточные состояния во время перепрограммирования 6-8. К сожалению, механизмы, лежащие в основе процесса перепрограммирования до сих пор полностью не поняты и, следовательно, точные различия между методами перепрограммирования также остаются быть defined. Таким образом, методы мониторинга, оценки и сравнения перепрограммирования события продолжают иметь решающее значение для поля стволовых клеток.

Методы, описанные в данном протоколе разрешают мониторинг и оценку процесса перепрограммирования и иллюстрации того, как эти методы могут быть использованы для сравнения различных наборов реагентов перепрограммирование. Первый подход включает в себя анализ методом проточной цитометрии с использованием комбинации антител против положительного и отрицательного плюрипотентных стволовых клеток (PSC) маркеров. Второй подход пары в реальном времени визуализации и измерения общего слияния (процент площади поверхности, покрытой клетками) и слияния габаритных сигналов (процент площади поверхности, покрытой флуоресцентных сигналов).

Protocol

1.Solution и среднего Приготовление Базальная мембрана Матрица (Очищенная от Engelbreth-Holm-Swarm Опухоли) Медленно разморозить матрицу базальной мембраны (5 мл) на льду при температуре 4 ° С в течение ночи. Разбавляют исходный раствор 1: 1 с 5 мл охлажденного льдом, стерильной …

Representative Results

Мониторинг Кинетика перепрограммировать с помощью проточной цитометрии CD44 является маркером в то время как фибробласты SSEA4 является PSC маркером 6,10. Как и следовало ожидать от этого паттерна экспрессии, проточной цитом…

Discussion

This study provides strategies for monitoring and tracking of the reprogramming process using flow cytometry and real-time imaging-based analysis. The critical steps in the protocol are initiating reprogramming, measuring reprogramming progression based on marker expression and real-time monitoring of reprogramming. Any reprogramming method of choice can be used but here we focus on Sendai based reprogramming of human fibroblasts. The advantage of this method is the ease of use and consistent high efficiency of reprogram…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят Чад Макартура за полезные обсуждения.

Materials

DMEM, high glucose, GlutaMAXSupplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 10569-010
Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified, US origin Thermo Fisher Scientific 16141-061
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Thermo Fisher Scientific 11140-050
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red  Thermo Fisher Scientific 25300-054
Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts Thermo Fisher Scientific A24903
Attachment Factor Protein (1X) Thermo Fisher Scientific S-006-100
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 10565-018
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828010
2-Mercaptoethanol (55 mM) Thermo Fisher Scientific 21985-023
Collagenase, Type IV, powder Thermo Fisher Scientific 17104-019
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red  Thermo Fisher Scientific 12563-011
DPBS, no calcium, no magnesium  Thermo Fisher Scientific 14190-144
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413302
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein Thermo Fisher Scientific PHG0264
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific 15575-020
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) Thermo Fisher Scientific 15260-037
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15630-080
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-122
InSolution Y-27632 EMD Millipore 688001
CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A1378001
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A16517
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
Countess Cell Counting Chamber Slides Thermo Fisher Scientific C10228
BJ ATCC Human Foreskin Fibroblasts, Neonatal ATCC CRL-2522
DF1 Adult Human Dermal Fibroblast Thermo Fisher Scientific N/A
BG01V/hOG Cells Variant hESC hOct4-GFP Reporter Cells Thermo Fisher Scientific R7799-105
IncuCyte ZOOM Essen BioScience
SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate (MC813-70) Thermo Fisher Scientific SSEA421
SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70)) Thermo Fisher Scientific A14810
SSEA-4 Antibody (MC813-70) Thermo Fisher Scientific 41-4000
TRA-1-60 Antibody (cl.A) Thermo Fisher Scientific  41-1000
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7), PE-Cy5 conjugate Thermo Fisher Scientific A27094
CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging Thermo Fisher Scientific A25528
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clone IM7) Thermo Fisher Scientific RM-5700 (no longer available)
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Thermo Fisher Scientific  A-11029
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher Scientific  A-11007
Alkaline Phosphatase Live Stain Thermo Fisher Scientific A14353
TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging Thermo Fisher Scientific A25618
CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), FITC conjugate Thermo Fisher Scientific MHCD2401
beta-2 Microglobulin Antibody, FITC conjugate (B2M-01) Thermo Fisher Scientific A15737
EpCAM / CD326 Antibody, FITC conjugate (VU-1D9) Thermo Fisher Scientific A15755
CD73 / NT5E Antibody (7G2) Thermo Fisher Scientific 41-0200
VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit Vector Laboratories SK-5100
Zeiss Axio Observer.Z1 microscope  Carl Zeiss 491912-0003-000
FlowJo Data Analysis Software FLOJO, LLC N/A
Attune Accoustic Focusing Cytometer, Blue/Red Laser Thermo Fisher Scientific Use Attune NXT 
S3e Cell Sorter (488/561 nm) BIO-RAD 1451006
Falcon 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap Corning 352235
Falcon 15 mL, high-clarity, dome-seal screw cap Corning 352097
Falcon T-75 Flask Corning 353136
Falcon T-175 Flask Corning 353112
Falcon 6-well dish Corning 353046
HERAEUS HERACELL CO2 ROLLING INCUBATOR Thermo Fisher Scientific 51013669
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL AM12450
HulaMixer Sample Mixer 15920D

References

  1. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
  2. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, 295-305 (2012).
  3. Kamata, M., Liang, M., Liu, S., Nagaoka, Y., Chen, I. S. Live cell monitoring of hiPSC generation and differentiation using differential expression of endogenous microRNAs. PLoS One. 5, e11834 (2010).
  4. Vendrell, M., Zhai, D., Er, J. C., Chang, Y. T. Combinatorial strategies in fluorescent probe development. Chem Rev. 112, 4391-4420 (2012).
  5. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
  6. Quintanilla, R. H., Asprer, J. S., Vaz, C., Tanavde, V., Lakshmipathy, U. CD44 is a negative cell surface marker for pluripotent stem cell identification during human fibroblast reprogramming. PLoS One. 9, e85419 (2014).
  7. Papp, B., Plath, K. Reprogramming to pluripotency: stepwise resetting of the epigenetic landscape. Cell Res. 21, 486-501 (2011).
  8. Nefzger, C. M., Alaei, S., Knaupp, A. S., Holmes, M. L., Polo, J. M. Cell surface marker mediated purification of iPS cell intermediates from a reprogrammable mouse model. J Vis Exp. , e51728 (2014).
  9. Xu, C., et al. Immortalized fibroblast-like cells derived from human embryonic stem cells support undifferentiated cell growth. Stem Cells. 22, 972-980 (2004).
  10. International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25, 803-816 (2007).
  11. Singh, U., et al. Novel live alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 8, 1021-1029 (2012).
  12. Naujok, O., Lenzen, S. A critical re-evaluation of CD24-positivity of human embryonic stem cells differentiated into pancreatic progenitors. Stem Cell Rev. 8, 779-791 (2012).
  13. Ramirez, J. M., et al. Brief report: benchmarking human pluripotent stem cell markers during differentiation into the three germ layers unveils a striking heterogeneity: all markers are not equal. Stem Cells. 29, 1469-1474 (2011).
  14. Huang, H. P., et al. Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) complex proteins promote transcription factor-mediated pluripotency reprogramming. J Biol Chem. 286, 33520-33532 (2011).
  15. Kolle, G., et al. Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling. Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).
  16. Thyagarajan, B., et al. Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase. Stem Cells. 26, 119-126 (2008).

Play Video

Cite This Article
Quintanilla Jr., R. H., Asprer, J., Sylakowski, K., Lakshmipathy, U. Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming. J. Vis. Exp. (113), e54190, doi:10.3791/54190 (2016).

View Video