Kinetic Mesure et visualisation en temps réel de Reprogrammation somatique
Summary
Le protocole présenté dans cette étude décrit des procédés pour la surveillance en temps réel de la progression de la reprogrammation par l'intermédiaire de la mesure cinétique des marqueurs de cellules souches pluripotentes positives et négatives à l'aide de l'analyse de cytométrie en flux. Le protocole comprend également l'évaluation fondée sur l'imagerie-de la morphologie, et le marqueur ou l'expression rapporteur lors de la génération iPSC.
Abstract
Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease phenotypes. Recent advances have identified more efficient and safe methods for introduction of reprogramming factors. However, there are few tools to monitor and track the progression of reprogramming. Current methods for monitoring reprogramming rely on the qualitative inspection of morphology or staining with stem cell-specific dyes and antibodies. Tools to dissect the progression of iPSC generation can help better understand the process under different conditions from diverse cell sources.
This study presents key approaches for kinetic measurement of reprogramming progression using flow cytometry as well as real-time monitoring via imaging. To measure the kinetics of reprogramming, flow analysis was performed at discrete time points using antibodies against positive and negative pluripotent stem cell markers. The combination of real-time visualization and flow analysis enables the quantitative study of reprogramming at different stages and provides a more accurate comparison of different systems and methods. Real-time, image-based analysis was used for the continuous monitoring of fibroblasts as they are reprogrammed in a feeder-free medium system. The kinetics of colony formation was measured based on confluence in the phase contrast or fluorescence channels after staining with live alkaline phosphatase dye or antibodies against SSEA4 or TRA-1-60. The results indicated that measurement of confluence provides semi-quantitative metrics to monitor the progression of reprogramming.
Introduction
les cellules de patients dérivées induites souches pluripotentes (CISP) sont des outils prometteurs pour la thérapie cellulaire et le criblage de médicaments. Elles fournissent une source autologue de cellules pour la thérapie. En outre, ils englobent un très large éventail de fonds génétiques, ce qui permet une analyse détaillée in vitro de maladies génétiques au – delà des lignes de courant les cellules souches embryonnaires (ESC) permettrait. Des progrès récents ont conduit au développement de plusieurs procédés pour produire iPSCs, y compris une reprogrammation avec le virus Sendai, des plasmides épisomiques ou ARNm 1,2. Notamment, les différentes méthodes de reprogrammation sont associés à des niveaux d'efficacité et de sécurité différents, et sont susceptibles de différer d'autres façons qui influent sur leur pertinence pour diverses applications. Avec la disponibilité d'une variété de technologies de reprogrammation, il est devenu important de développer des méthodes pour évaluer le processus de reprogrammation. La plupart des méthodes existantes reposent sur l'inspection qualitative de la morphologie ou la colorationavec des colorants et des anticorps spécifiques de cellules souches. Une méthode développée récemment fait appel à des journalistes de fluorescence lentiviraux qui sont sensibles aux miARN spécifiques à la CFP ou des ARNm spécifiques de cellules différenciées 3. Ces méthodes de surveillance facilitent la sélection et l'optimisation des techniques de reprogrammation pour des situations différentes. Par exemple, CDy1 a été utilisé comme une sonde fluorescente pour le début de CSPi afin de dépister des modulateurs de reprogrammation 4. La capacité d'observer et de comparer les différentes expériences de reprogrammation est également critique pour une meilleure compréhension du processus lui-même. Par exemple, on sait maintenant que certains types de cellules somatiques sont plus faciles à reprogrammer 5 que d' autres, et que les cellules passent par des états intermédiaires pendant la reprogrammation 6-8. Malheureusement, les mécanismes sous-jacents du processus de reprogrammation ne sont pas encore complètement compris et, par conséquent, les différences exactes entre les méthodes de reprogrammation restent également à defined. Ainsi, les méthodes de suivi, d'évaluation et de comparaison des événements de reprogrammation continuent d'être critique pour le domaine des cellules souches.
Les méthodes décrites dans ce protocole permettent le suivi et l'évaluation du processus de reprogrammation et illustrent la façon dont ces techniques peuvent être utilisées pour comparer les différents ensembles de réactifs de reprogrammation. La première approche consiste à cytométrie en flux analyse en utilisant des combinaisons d'anticorps dirigés contre la cellule positive et négative souches pluripotentes (PSC) des marqueurs. Le second couple d'approche imagerie en temps réel et la mesure de la confluence totale (la surface couverte pour cent par les cellules) et la confluence des signaux de marqueur (la surface couverte pour cent par les signaux fluorescents).
Protocol
Representative Results
Discussion
This study provides strategies for monitoring and tracking of the reprogramming process using flow cytometry and real-time imaging-based analysis. The critical steps in the protocol are initiating reprogramming, measuring reprogramming progression based on marker expression and real-time monitoring of reprogramming. Any reprogramming method of choice can be used but here we focus on Sendai based reprogramming of human fibroblasts. The advantage of this method is the ease of use and consistent high efficiency of reprogram…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Tchad MacArthur pour des discussions utiles.
Materials
| DMEM, high glucose, GlutaMAXSupplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16141-061 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
| Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts | Thermo Fisher Scientific | A24903 | |
| Attachment Factor Protein (1X) | Thermo Fisher Scientific | S-006-100 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 10565-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| Collagenase, Type IV, powder | Thermo Fisher Scientific | 17104-019 | |
| TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12563-011 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0264 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-020 | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | Thermo Fisher Scientific | 15260-037 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| InSolution Y-27632 | EMD Millipore | 688001 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| BJ ATCC Human Foreskin Fibroblasts, Neonatal | ATCC | CRL-2522 | |
| DF1 Adult Human Dermal Fibroblast | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| BG01V/hOG Cells Variant hESC hOct4-GFP Reporter Cells | Thermo Fisher Scientific | R7799-105 | |
| IncuCyte ZOOM | Essen BioScience | ||
| SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | SSEA421 | |
| SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70)) | Thermo Fisher Scientific | A14810 | |
| SSEA-4 Antibody (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | 41-4000 | |
| TRA-1-60 Antibody (cl.A) | Thermo Fisher Scientific | 41-1000 | |
| CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7), PE-Cy5 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A27094 | |
| CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | A25528 | |
| CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clone IM7) | Thermo Fisher Scientific | RM-5700 (no longer available) | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11007 | |
| Alkaline Phosphatase Live Stain | Thermo Fisher Scientific | A14353 | |
| TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | A25618 | |
| CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), FITC conjugate | Thermo Fisher Scientific | MHCD2401 | |
| beta-2 Microglobulin Antibody, FITC conjugate (B2M-01) | Thermo Fisher Scientific | A15737 | |
| EpCAM / CD326 Antibody, FITC conjugate (VU-1D9) | Thermo Fisher Scientific | A15755 | |
| CD73 / NT5E Antibody (7G2) | Thermo Fisher Scientific | 41-0200 | |
| VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| Zeiss Axio Observer.Z1 microscope | Carl Zeiss | 491912-0003-000 | |
| FlowJo Data Analysis Software | FLOJO, LLC | N/A | |
| Attune Accoustic Focusing Cytometer, Blue/Red Laser | Thermo Fisher Scientific | Use Attune NXT | |
| S3e Cell Sorter (488/561 nm) | BIO-RAD | 1451006 | |
| Falcon 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap | Corning | 352235 | |
| Falcon 15 mL, high-clarity, dome-seal screw cap | Corning | 352097 | |
| Falcon T-75 Flask | Corning | 353136 | |
| Falcon T-175 Flask | Corning | 353112 | |
| Falcon 6-well dish | Corning | 353046 | |
| HERAEUS HERACELL CO2 ROLLING INCUBATOR | Thermo Fisher Scientific | 51013669 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | AM12450 | ||
| HulaMixer Sample Mixer | 15920D |
References
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