الحركية قياس وفي الوقت الحقيقي التصور من إعادة برمجة الجسدية
Summary
يصف بروتوكول المعروضة في هذه الدراسة أساليب لرصد الوقت الحقيقي لتقدم برمجة عن طريق قياس الحركية من علامات الخلايا الجذعية المحفزة الإيجابية والسلبية باستخدام تحليل التدفق الخلوي. ويشمل البروتوكول أيضا على تقييم القائم على التصوير من التشكل، وعلامة أو التعبير مراسل خلال جيل التوجيهية.
Abstract
Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease phenotypes. Recent advances have identified more efficient and safe methods for introduction of reprogramming factors. However, there are few tools to monitor and track the progression of reprogramming. Current methods for monitoring reprogramming rely on the qualitative inspection of morphology or staining with stem cell-specific dyes and antibodies. Tools to dissect the progression of iPSC generation can help better understand the process under different conditions from diverse cell sources.
This study presents key approaches for kinetic measurement of reprogramming progression using flow cytometry as well as real-time monitoring via imaging. To measure the kinetics of reprogramming, flow analysis was performed at discrete time points using antibodies against positive and negative pluripotent stem cell markers. The combination of real-time visualization and flow analysis enables the quantitative study of reprogramming at different stages and provides a more accurate comparison of different systems and methods. Real-time, image-based analysis was used for the continuous monitoring of fibroblasts as they are reprogrammed in a feeder-free medium system. The kinetics of colony formation was measured based on confluence in the phase contrast or fluorescence channels after staining with live alkaline phosphatase dye or antibodies against SSEA4 or TRA-1-60. The results indicated that measurement of confluence provides semi-quantitative metrics to monitor the progression of reprogramming.
Introduction
الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة المشتقة من المريض (iPSCs) هي أدوات واعدة لعلاج الخلايا وفحص المخدرات. أنها توفر مصدر ذاتي للخلايا لعلاج. وبالإضافة إلى ذلك، فإنها تشمل مجموعة واسعة جدا من خلفيات وراثية، مما يتيح لفي المختبر تحليل مفصل للأمراض الوراثية وراء ما الخطوط الحالية الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) سيسمح. وقد أدت التطورات الحديثة في تطوير العديد من الطرق لتوليد iPSCs، بما في ذلك إعادة برمجة مع فيروس سينداي، البلازميدات episomal أو من mRNAs 1،2. والجدير بالذكر أن ترتبط طرق برمجة مختلفة مع مستويات الكفاءة والأمان متفاوتة، ومن المرجح أن تختلف في الطرق الأخرى التي تؤثر في مدى ملاءمتها لمختلف التطبيقات. مع توافر مجموعة متنوعة من تقنيات برمجة، أصبح من المهم وضع أساليب لتقييم عملية إعادة البرمجة. معظم الطرق الحالية تعتمد على التفتيش النوعي للالتشكل أو تلطيخمع الأصباغ والأجسام المضادة خلايا محددة الجذعية. واحد طريقة تم تطويرها مؤخرا يجعل من استخدام للصحفيين مضان lentiviral التي تعتبر حساسة لmiRNAs-PSC معين أو من mRNAs خلية محددة متباينة 3. هذه الطرق مراقبة تسهل اختيار وتعظيم الاستفادة من تقنيات إعادة برمجة لحالات مختلفة. على سبيل المثال، تم استخدام CDy1 باعتباره التحقيق الفلورسنت لiPSCs في وقت مبكر من أجل كشف عن جهري إعادة برمجة 4. القدرة على مراقبة ومقارنة التجارب برمجة مختلفة هو أمر حاسم لاكتساب فهم أفضل لعملية نفسها أيضا. على سبيل المثال، فمن المعروف الآن أن بعض أنواع الخلايا الجسدية هي أسهل لإعادة برمجة من غيرها 5، وأن الخلايا تمر عبر دول وسيطة خلال إعادة برمجة 6-8. وللأسف، فإن الآليات الكامنة وراء عملية إعادة برمجة لا تزال غير مفهومة تماما، وبالتالي، تبقى الاختلافات الدقيقة بين طرق برمجة أيضا أن defined. وبالتالي، فإن أساليب الرصد والتقييم، ومقارنة الأحداث برمجة أن تكون حاسمة لمجال الخلايا الجذعية.
الأساليب المذكورة في هذا البروتوكول تسمح رصد وتقييم عملية إعادة برمجة وتوضح كيف أن هذه التقنيات يمكن أن تستخدم للمقارنة بين مجموعات مختلفة من الكواشف إعادة برمجة. ينطوي النهج الأول التدفق الخلوي التحليلات باستخدام مزيج من الأجسام المضادة ضد الإيجابية والسلبية الخلايا الجذعية المحفزة (PSC) علامات. الثانية الأزواج نهج التصوير في الوقت الحقيقي وقياس مجموع التقاء (منطقة في المئة السطح الخلايا المغطاة) والتقاء إشارات علامة (المنطقة في المئة السطح بواسطة إشارات الفلورسنت المغطاة).
Protocol
Representative Results
Discussion
This study provides strategies for monitoring and tracking of the reprogramming process using flow cytometry and real-time imaging-based analysis. The critical steps in the protocol are initiating reprogramming, measuring reprogramming progression based on marker expression and real-time monitoring of reprogramming. Any reprogramming method of choice can be used but here we focus on Sendai based reprogramming of human fibroblasts. The advantage of this method is the ease of use and consistent high efficiency of reprogram…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أشكر تشاد ماك آرثر لإجراء مناقشات مفيدة.
Materials
| DMEM, high glucose, GlutaMAXSupplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16141-061 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
| Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts | Thermo Fisher Scientific | A24903 | |
| Attachment Factor Protein (1X) | Thermo Fisher Scientific | S-006-100 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 10565-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| Collagenase, Type IV, powder | Thermo Fisher Scientific | 17104-019 | |
| TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12563-011 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0264 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-020 | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | Thermo Fisher Scientific | 15260-037 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| InSolution Y-27632 | EMD Millipore | 688001 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| BJ ATCC Human Foreskin Fibroblasts, Neonatal | ATCC | CRL-2522 | |
| DF1 Adult Human Dermal Fibroblast | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| BG01V/hOG Cells Variant hESC hOct4-GFP Reporter Cells | Thermo Fisher Scientific | R7799-105 | |
| IncuCyte ZOOM | Essen BioScience | ||
| SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | SSEA421 | |
| SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70)) | Thermo Fisher Scientific | A14810 | |
| SSEA-4 Antibody (MC813-70) | Thermo Fisher Scientific | 41-4000 | |
| TRA-1-60 Antibody (cl.A) | Thermo Fisher Scientific | 41-1000 | |
| CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7), PE-Cy5 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A27094 | |
| CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | A25528 | |
| CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clone IM7) | Thermo Fisher Scientific | RM-5700 (no longer available) | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11007 | |
| Alkaline Phosphatase Live Stain | Thermo Fisher Scientific | A14353 | |
| TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | A25618 | |
| CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), FITC conjugate | Thermo Fisher Scientific | MHCD2401 | |
| beta-2 Microglobulin Antibody, FITC conjugate (B2M-01) | Thermo Fisher Scientific | A15737 | |
| EpCAM / CD326 Antibody, FITC conjugate (VU-1D9) | Thermo Fisher Scientific | A15755 | |
| CD73 / NT5E Antibody (7G2) | Thermo Fisher Scientific | 41-0200 | |
| VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| Zeiss Axio Observer.Z1 microscope | Carl Zeiss | 491912-0003-000 | |
| FlowJo Data Analysis Software | FLOJO, LLC | N/A | |
| Attune Accoustic Focusing Cytometer, Blue/Red Laser | Thermo Fisher Scientific | Use Attune NXT | |
| S3e Cell Sorter (488/561 nm) | BIO-RAD | 1451006 | |
| Falcon 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap | Corning | 352235 | |
| Falcon 15 mL, high-clarity, dome-seal screw cap | Corning | 352097 | |
| Falcon T-75 Flask | Corning | 353136 | |
| Falcon T-175 Flask | Corning | 353112 | |
| Falcon 6-well dish | Corning | 353046 | |
| HERAEUS HERACELL CO2 ROLLING INCUBATOR | Thermo Fisher Scientific | 51013669 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | AM12450 | ||
| HulaMixer Sample Mixer | 15920D |
References
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481, 295-305 (2012).
- Kamata, M., Liang, M., Liu, S., Nagaoka, Y., Chen, I. S. Live cell monitoring of hiPSC generation and differentiation using differential expression of endogenous microRNAs. PLoS One. 5, e11834 (2010).
- Vendrell, M., Zhai, D., Er, J. C., Chang, Y. T. Combinatorial strategies in fluorescent probe development. Chem Rev. 112, 4391-4420 (2012).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
- Quintanilla, R. H., Asprer, J. S., Vaz, C., Tanavde, V., Lakshmipathy, U. CD44 is a negative cell surface marker for pluripotent stem cell identification during human fibroblast reprogramming. PLoS One. 9, e85419 (2014).
- Papp, B., Plath, K. Reprogramming to pluripotency: stepwise resetting of the epigenetic landscape. Cell Res. 21, 486-501 (2011).
- Nefzger, C. M., Alaei, S., Knaupp, A. S., Holmes, M. L., Polo, J. M. Cell surface marker mediated purification of iPS cell intermediates from a reprogrammable mouse model. J Vis Exp. , e51728 (2014).
- Xu, C., et al. Immortalized fibroblast-like cells derived from human embryonic stem cells support undifferentiated cell growth. Stem Cells. 22, 972-980 (2004).
- International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat Biotechnol. 25, 803-816 (2007).
- Singh, U., et al. Novel live alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 8, 1021-1029 (2012).
- Naujok, O., Lenzen, S. A critical re-evaluation of CD24-positivity of human embryonic stem cells differentiated into pancreatic progenitors. Stem Cell Rev. 8, 779-791 (2012).
- Ramirez, J. M., et al. Brief report: benchmarking human pluripotent stem cell markers during differentiation into the three germ layers unveils a striking heterogeneity: all markers are not equal. Stem Cells. 29, 1469-1474 (2011).
- Huang, H. P., et al. Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) complex proteins promote transcription factor-mediated pluripotency reprogramming. J Biol Chem. 286, 33520-33532 (2011).
- Kolle, G., et al. Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling. Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).
- Thyagarajan, B., et al. Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase. Stem Cells. 26, 119-126 (2008).
