Isolatie van muizen embryonale Hemogenic endotheelcellen

Ethiek Verklaring: Het protocol hieronder beschreven is door en in overeenstemming is met de richtlijnen van, Yale University's Institutional Animal Care en gebruik Comite. 1. Hele Embryo Ex V ivo Cultuur voor Yolk Sac Studies (optioneel) Euthanize zwangere dammen bij E7.0 – E7.5 en verwijder baarmoederhoorns onder steriele omstandigheden, zoals in meer detail hieronder (stappen 2,4-2,7). Aparte hele embryo's (met dooierzak intact 12) uit de omliggende decidua en te schorten in 50 ml hele rat serum in 50 ml polystyreen buizen. Gas embryo flessen voor 3 minuten met 5% CO 2 direct zoals eerder beschreven 12,18. Herhaal deze stap bij 24 uur als het kweken van embryo's voor 24 – 48 uur. Incubeer bij 37 ° C rolling kweek gedurende 48 uur. Let op: Embryo's kunnen worden behandeld ex vivo met farmacologische middelen (dat wil zeggen, Notch inhibitor DAP.T 12) of oplosbare eiwitten (bijv fibronectine 19) door middel van pre-incubatie van embryo's voor maximaal 2 uur in kweekmedium dat dergelijke factoren, hetzij door toevoeging van deze elementen aan het rollen kweekmedium voor de gehele lengte van het ex vivo kweken periode. Genexpressie kan worden gemanipuleerd embryo door voorincubatie van embryo's met optimaal getitreerd lentivirus gedurende 2 uur 12. Dooierzak vasculaire en hematopoietische ontwikkeling kan worden gecontroleerd in real-time met behulp van transgene reporter muizen en optische beeldvormende technieken. 2. Dissectie van Yolk Sac (ys) of Aorta-gonaden-mesonephros (AVA) van muizenembryo's Steriliseren labtafel door het sproeien en vegen neer alle oppervlakken met 70% ethanol om besmetting in de daaropvolgende celculturen te verminderen. Goed absorberende onderlegger op labtafel oppervlak. Steriliseren chirurgische instrumenten met 70% ethanol. Aanbevolen chirurgische instrumenten zijn twee # 5 rechte krachtps, en een 8,5 cm recht schaar. Als het werken met embryo's uit ex vivo cultuur, verwijder voorzichtig hele embryo's uit 50 ml Falcon buizen en ga direct naar stap 2.8. Anders, deze stap overslaan en ga dan naar stap 2.4. Euthanaseren zwangere dam op geschikte embryonale leeftijd (E8.5 als het oogsten YS; E10.5 indien oogsten AVA). Opmerking: De beschreven techniek maakt gebruik van een dual-methode euthanasie aanpak – dodelijke dosis van een vluchtig anestheticum gevolgd door een mechanische cervicale dislocatie – te minimaliseren dier pijn en angst, en minimaal invasieve en humane beëindiging van proefdieren te waarborgen. Deze gecombineerde techniek voor kleine knaagdieren euthanasie wordt aanbevolen door de American Veterinary Medical Association wanneer deze wordt uitgevoerd door een opgeleide en ervaren onderzoeker (AVMA Richtlijnen voor de euthanasie van dieren: 2013 Edition). Verdoven muis met een letale dosis isofluraan (> 5% in O 2) gedurende 3-5 min. (CautiON: Isofluraan is een giftig inhalatie; gebruiken onder een chemische dampkap met geschikte adembescherming persoonlijke beschermingsmiddelen.) Na blootstelling van muizen aan isofluraan, controleren ten minste drie tekenen van verdoving niveau – meer verlies van evenwicht, verlies van teen knijpen reflex, en vermindering van de ademfrequentie – onderwerpen te verzekeren hebben een diepe narcose vlak voorafgaand bereikt om te gaan met mechanische euthanasie. Cervicaal ontwrichten dam om snel de dood veroorzaken. Plaats geëuthanaseerd dam liggende op onderlegger en royaal spuiten onderbuik met 70% ethanol. Voeg een verticale incisie langs de middellijn van de onderbuik. Voeg extra ~ 1 inch horizontaal uitstrekkende insnijdingen rechts en links van het midden van de verticale incisie en ontleden weg de buikwand naar rechts en links baarmoederhoorns elk meerdere dragende embryo volledig bloot. Met behulp van een tang, houdt u een van de twee baarmoederhoornsen gebruik een schaar om het scheiden van de mesometrium. Plaats ontleed baarmoeder op ijs in steriele Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) in een 60 mm polystyreen weefselkweek plaat. Herhaal dit voor andere baarmoeder hoorn. Onder een standaard licht dissectie microscoop, een tang om spierlaag van de baarmoeder sac weg te trekken om de onderliggende vruchtzak en decidua onthullen. Isoleer YS (Figuur 2A) door voorzichtig verwijderen van de zak uit de bijgevoegde embryo. Verwijderen YS weefsel van embryo in de embryonale oorsprong van vitelline schepen. Aan de AVA te isoleren, verwijder de YS en doorsnijden het embryo onder het niveau van het hart en de voorpoten en gooi de borstkas en het hoofd regio. Vervolgens doorsnijden het embryo net onder het niveau van de achterpoten en te verwijderen en gooi de staart weefsel. Verwijder de achterpoten en overtollige ventrale weefsel van de overblijvende sectie, die de AVA (Figuur 2B) bevat. Pool YS of AGM weefsels van meerdere embryo's en op te slaanop ijs in HBSS + (HBSS aangevuld met 10% (v / v) foetaal runderserum en 100 E / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 0,3 mg / ml L-glutamine) in een schone buis van 1,5 ml. 3. Digestie van Primary weefsel in een enkele celsuspensie Centrifugebuis die geoogst YS of AGM weefsels gedurende 5 minuten bij 2000 xg bij 4 ° C. Verwijder supernatant en resuspendeer weefsel in 1 ml van ofwel 0,05% (voor ys) of 0,2% (voor AGM) collagenase type II verdund in HBSS +. Incubeer gedurende 30 min in een waterbad bij 37 ° C, het buisje elke 5 min te mengen. Voorzichtig mechanisch distantiëren weefsel door het passeren van het monster 10 keer door middel van een P1000 pipet. Als problemen met het opzuigen van gedeeltelijk verteerd weefsel, kan pipetpunt boring worden verruimd door het afsnijden van ~ 5 mm van de tip met een schaar. Centrifugeer monster gedurende 5 min bij 2000 xg bij 4 ° C. Verwijder supernatant en resuspendeer in 1 ml ijskoude HBSS +. Passeren monster door een 70 &# 956; m cel zeef. Aantal cellen met een handmatige of geautomatiseerde hemocytometer. Centrifugeer monster gedurende 5 min bij 2000 xg bij 4 ° C. Resuspendeer monster in DMEM + (4,5 g / l glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium aangevuld met 10% (v / v) foetaal runderserum en 100 E / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 0,3 mg / ml L-glutamine) pre- verwarmd tot 37 ° C zodanig dat cellen in een eindconcentratie van 1 x 10 6 cellen / ml. 4. De behandeling van cellen met nucleïnezuur Dye en Labeling met fluorescent geconjugeerde antilichamen Aliquot tenminste 100 gl monster (1 x 10 5 cellen) in vers 1,5 ml buizen voor antilichaam incubatie. Neem de volgende monster en de nodige controle buizen: Ongekleurde; Alleen cKit-APC; Alleen CD45-FITC; Alleen CD31-PE; Alleen Flk1-PECy7; Hoechst 33342 alleen; Hoechst 33342 alleen + verapamil; Monster (ontvangt alle kleuren, zal Verapamil niet ontvangen). Gebruik ten minste 1 x 10 <sup> 5 cellen in 100 ul voor controlebuizen. Opmerking: Een groter volume aan cellen aan de monsterbuis toegevoegd in dezelfde concentratie aan opbrengst gesorteerd Hemogenic EG en HSPC maximaliseren. Voeg Verapamil verdund in 95% ethanol (zie Lees rationale) aan de "Hoechst 33342 Alleen + verapamil" controlebuis tot een eindconcentratie van 50 uM. Incubeer alle buizen gedurende 5 minuten bij 37 ° C. (LET OP: Verapamil is een krachtige calcium-kanaal blokkerende middel en is zeer giftig Handle with handschoenen.). Voeg Hoechst 33342 van "Hoechst 33342 only" control, de Hoechst 33342 + Verapamil alleen controle en het "Monster" buis tot een eindconcentratie van 5 ug / ml. Incubeer alle buizen gedurende 1 uur bij 37 ° C, beschermd tegen licht. Voorzichtig meng door elke 15 min. (LET OP: Hoechst 33342 is een giftig nucleair kleurstof en moet met handschoenen worden behandeld). Centrifuge alle samples gedurende 5 minuten bij 2000 xg bij 4 ° C. Verwijder supernatant en resuspendeer celpellets in een concentratie van 1 x 10 5 cellen / ml in koude HBSS +. Voeg fluorescent geconjugeerde antilichamen passende antilichaam alleen controlebuizen en het "Monster" buis tot een eindconcentratie van 2 ug / ml. Incubeer op ijs gedurende 30 min, beschermd tegen licht. Centrifuge alle buizen gedurende 5 minuten bij 2000 xg bij 4 ° C. Verwijder supernatant en resuspendeer de cel pellet in 500 ul ijskoude HBSS. Strain monsters door middel van mesh filter cap van 5 ml ronde bodem polystyreen FACS buis en op te slaan op ijs, beschermd tegen licht, voor onmiddellijke FACS. 5. Identificatie en isolatie van Hemogenic endotheelcellen en HSPC door FACS Opmerking: Dit protocol werd geoptimaliseerd onder toepassing van een BD FACSAria 5-lasersysteem met een 100 mw 355 nm UV laser, een 200 mw 405 nm Violet laser, een 200 mw 488 nm blauwe laser, een 200 mw 532 nm groene laser en een 150 mw 637 nm Redlaser. Cellen werden gesorteerd in steriele PBS als omhullingfluïdum en onder aseptische omstandigheden, en door een 100 um mondstuk met stromingssnelheid ingesteld op een gemeten druk van 1, zodat maximaal 1500 – 2000 events per seconde verworven celstress minimaliseren. Onder deze hierboven beschreven instellingen gebruik "Ongekleurde" en één kleurcontrole buizen FACS celsortering laserintensiteiten optimaliseren en uitvoeren meerkleurige spectrale compensatieregeling volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik vooruit en zijwaartse verstrooiing naar levende cellen uit te voeren en doublet discriminatie van total evenementen (zie de instructies van de fabrikant voor meer informatie). Opmerking: Dit protocol resulteert typisch in ~ 70-80% levensvatbare cellen. Als er problemen worden ondervonden met lage levensvatbaarheid van de cellen, ervoor te zorgen dat de weefsels in eerste instantie snel worden ontleed in ijskoude media, en dat alle stappen met uitzondering van die op andere wijze te specificeren op ijs worden uitgevoerd, met zachte pipetteren te snijden en celdood te minimaliseren(Zie: Lees meer details over het behoud van levensvatbaarheid van de cellen). Gebruik een differentiële lineaire schaal perceel van Hoechst Red versus Blue Hoechst fluorescentie side population (SP) evenementen (figuur 3A) te identificeren. Gebruik "Hoechst 33342 alleen + Verapamil" control als een negatieve controle om te controleren of de juiste poorten worden getrokken voor de steekproef. SP weergegeven als schouder links van de niet-SP cellen, en zal afnemen in de verapamil-behandelde controle. De niet-SP bevolking worden gebruikt om niet-hemogenic EC (figuur 3B) te identificeren. Maak extra differentiële fluorescentie plots (log-schaal assen) en trek dochter poorten van de SP om hemogenic endotheelcellen (Figuur 3C-E) te identificeren. Opmerking: Hemogenic endotheelcellen geprofileerd als Flk1 + / cKit + / CD45- cellen SP (Figuur 3D) en HSPC zijn Flk1- / cKit + / CD45 + cellen SP (Figuur 3E). Hemogenic endotheliale cells kunnen parallel worden geanalyseerd met niet-hemogenic endotheelcellen, waarvan in deze benadering CD31 + / CD45- non-SP cellen (Figuur 3B). Ophalen hemogenic endotheelcel of HSPC fractie op methylcellulose bevattende platen voor hematopoietische kweek (zie hieronder), of in andere buffers voor verdere verwerking en analyse. 6. hematopoietische Differentiatie in Cultuur Voeg 0,5 ml (135 pl / cm2)-methylcellulose gebaseerde hematopoietische kweekmedia gewenste aantal putten van een 24-well weefselkweekplaat bij kamertemperatuur. Voeg 0,5 ml steriel water in ongebruikte putten om verdamping te minimaliseren. Bereid fris en houden bij kamertemperatuur tot gebruik. Sorteren 1-10 cellen voor klonale analyse, of tot 1000 hemogenic endotheelcellen (Flk1 + / cKit + / CD45- SP cellen) of HSPC (Flk1- / cKit + / CD45 + SP cellen) voor bulk expansie en differentiatie direct in elk putje van deplaat met methylcellulose. Kolonievorming wordt aangetroffen bij ongeveer 10 – 20%. In een steriele weefselkweek kap, gebruik dan een P1000 tip met het uiteinde bijgesneden tot de boring te verbreden, om voorzichtig resuspendeer elk putje van de gezaaide methylcellulose media 2-3 keer, en zorg voor de schepping van luchtbellen te vermijden. Hierdoor suspensie van de gesorteerde cellen in de halfvaste methylcellulose voor optimale groei. Incubeer plaat bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende maximaal 2 weken. Monitor enkelvoudige celkweken voor de vorming van gedifferentieerde hematopoëtische cellen kolonies tijd (figuur 4). Score putjes aantal en type van gedifferentieerde hematopoëtische kolonies op dag 1, 3, 7 en 14 met methode (s) hieronder weergegeven in stap 6,7. Score platen op dag 1 tot confluentie en levensvatbaarheid van de gesorteerde cellen bevestigen. Per dag 3, kijk voor de vroege vorming van hechtende hemogenic endotheelcellen kolonies met "kasseientone "morfologie (zie Goldie et al. 11 en Marcelo et al. 12 voor de vertegenwoordiging van de dag 3 morfologie). Per dag 5-7, controleer voor de vorming van afgeronde HSPC clusters in putjes die naargelang hemogenic EC. HSPC moeten naast worden genomen om hemogenic EG van het weergeven van een "geplaveide" endotheelcellen morfologie afgevlakt. Opmerking: Hemogenic endotheelcellen moet hematopoïetische kolonies (bepaald volgens hematopoietische kolonieaantal) te vormen, en moeten aantonen multi-lijn differentiatievermogen (bepaald door waarneming van meerdere types kolonie van een enkele cel). We hebben eerder opgemerkt dat ~ 20% van hemogenic EG of HSPC opgehaald door FACS overleven te vormen differentiëren en prolifereren hematopoiëtische kolonies in methylcellulose 11. Om de vorming van kolonies door fase microscopie te beoordelen: Visualiseren en te tellen kolonies bij een lage vergroting under een fase lichtmicroscoop en identificeren BFU-E, CFU-GM, en CFU-GEMM kolonies door koloniemorfologie, zoals beschreven door Goldie et al. 11. Om de vorming van kolonies door celmorfologie te beoordelen: Aspireren individuele kolonies van methylcellulose oppervlak in een P1000 tip met het uiteinde bijgesneden tot boring verbreden. Dit vergemakkelijkt het streven van de viskeuze methylcellulose medium en zorgt voor succesvolle ophalen van de kolonie. Resuspendeer kolonies opgepikt in 200 ml HBSS en centrifugeren op een glasplaatje met behulp van een cytocentrifuge bij 28 xg gedurende 5 minuten. Fix dia's in 100% methanol gedurende 5 minuten (LET OP: Methanol is giftig en mag alleen worden gebruikt in een chemische kap met gepaste ventilatie en persoonlijke beschermingsmiddelen). Dompel dia's in 0,04% Giemsa kleuring gedurende 20 min (LET OP:. Giemsa stain bevat methanol Gebruik in een chemische kap met gepaste ventilatie en persoonal beschermingsmiddelen). Spoel de dia's in gedemineraliseerd water. Mount dia's met dekglaasjes, en het beeld bij een sterke vergroting onder een standaard lichtmicroscoop, het vergelijken van celmorfologie met die klassiek waargenomen in hematopoietische cellen uit volwassen beenmerg die gekweekt in methylcellulose media. Voor voorbeelden, zie instructies van de fabrikant. Om de vorming van kolonies door cel expressie van hematopoietische afkomst markers door FACS te beoordelen: Voeg 2 ml HBSS aan elk putje van een 24-well plaat met kolonies gekweekt op 0,5 ml methylcellulose (bijv verdunde commercieel verkrijgbare voorraad methylcellulose 1: 4). Pipet op en neer om te mengen, en transfer naar nieuwe buis (s). Centrifugeer monster bij 2000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C met een standaard tafelmodel microcentrifuge. Verwijder supernatant en resuspendeer celpellet (s) in 1 ml HBSS +, het bundelen van monsters indien gewenst. centrifugalege monster bij 2000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder supernatant en resuspendeer celpellet (s) in 400 ul HBSS +. Aliquot monster in vier 1,5 ml buizen als volgt: Ongekleurde; Alleen B220-FITC; GR-1-FITC alleen; Alleen TER119-FITC. Add fluorescent geconjugeerd antilichaam aan juiste buisje een eindconcentratie van 2 ug / ml. Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten. Centrifugeer monster bij 2000 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder supernatant en resuspendeer de cel pellet in ijskoude 0,5 ml HBSS. Analyseer elk monster door FACS op expressie van elke hematopoietische afkomst marker: B220 markeert B-cellen 20; GR-1 merken myeloïde cellen 21; TER119 markeert erythroïde cellen 22. Opmerking toevoeg antilichamen gericht op andere hematopoietische afkomst merkers kunnen in deze benadering worden opgenomen, indien gewenst.