Aislamiento de las células murinas embrionarias Hemogenic endoteliales

Declaración de Ética: El protocolo se describe a continuación ha sido revisado por, y está en cumplimiento con las pautas de, Institucional Cuidado de Animales de la Universidad de Yale y el empleo. 1. Total de embriones Ex V ivo Cultura para la yema de Estudios Sac (Opcional) La eutanasia a presas embarazadas en E7.0 – E7.5, y eliminar cuernos uterinos en condiciones estériles, como se describe en mayor detalle a continuación (pasos 2.4 a 2.7). Embriones separados enteros (con saco vitelino intacta 12) de decidua rodea, y suspender en 50 ml de suero de rata entera en tubos de 50 ml de poliestireno. Botellas de embrión de Gas de 3 min con 5% de CO 2 inmediatamente como se describió previamente 12,18. Repita este paso a las 24 horas, si el cultivo de embriones por 24 – 48 h. Incubar en el despliegue de la cultura 37 ° C durante un máximo de 48 horas. Nota: Los embriones pueden ser tratadas ex vivo con agentes farmacológicos (es decir, DAP inhibidor de Notch.T 12) o solubles de proteínas (es decir, fibronectina 19) a través de pre-incubación de embriones para un máximo de 2 horas en medio de cultivo que contienen dichos factores, o a través de adición de estos factores al medio de cultivo de laminación para toda la longitud de la cultura ex vivo período. La expresión génica puede ser manipulado en embriones de pre-incubación de embriones con lentivirus se titularon de manera óptima para 2 hr 12. Saco vitelino vascular y el desarrollo hematopoyético se pueden monitorizar en tiempo real utilizando reportero ratones transgénicos y las técnicas de imagen óptica. 2. Disección del saco vitelino (YS) o la aorta-gónada-mesonefros (AGM) a partir de embriones de ratón Esterilizar banco de laboratorio por pulverización y limpiando todas las superficies con 70% de etanol para reducir la contaminación en cultivos de células posteriores. Coloque una almohadilla inferior absorbente en la superficie de mesa de laboratorio. Esterilizar instrumentos quirúrgicos con 70% de etanol. instrumentos quirúrgicos recomendados son dos # 5 vigor rectaps, y una tijera de 8,5 cm rectas. Si se trabaja con embriones de cultivo ex vivo, retirar con cuidado los embriones enteros de 50 ml tubos Falcon y proceder inmediatamente al paso 2.8. De lo contrario, omita este paso y vaya al paso 2.4. La eutanasia presa embarazada a la edad embrionaria adecuada (E8.5 si YS cosecha; E10.5 si la cosecha AGM). Nota: La técnica descrita emplea un método de eutanasia método doble – dosis letal de un anestésico volátil seguido por dislocación cervical mecánica – para minimizar el dolor y el sufrimiento de los animales, y para asegurar la terminación mínimamente invasiva y humana de sujetos animales. Esta técnica combinada para la eutanasia pequeño roedor es recomendado por la American Veterinary Medical Association cuando es realizada por un investigador entrenado y competente (AVMA Directrices para la eutanasia de los animales: 2013 Edition). Anestesie ratón utilizando una dosis letal de isoflurano (> 5% en O 2) durante 3 – 5 min. (ITUACON: El isoflurano es un inhalante tóxico; utilizar bajo una campana de extracción química con el equipo de protección personal respiratoria adecuada.) Tras la exposición de los ratones al isoflurano, marcar al menos tres señales de nivel de anestesia – pérdida del reflejo de enderezamiento, la pérdida del reflejo del dedo del pie de presión y de reducción de la frecuencia respiratoria – para asegurar los sujetos han alcanzado un plano anestésico profundo antes de proceder con la eutanasia mecánica. Cervical dislocar la presa para inducir la muerte rápidamente. Colocar en posición supina presa sacrificados en underpad y liberalmente rociado inferior del abdomen con un 70% de etanol. Hacer una incisión vertical a lo largo de la línea media de la pared abdominal inferior. Hacen incisiones horizontales adicionales ~ 1 pulgada que se extiende a la derecha y la izquierda del punto medio de la incisión vertical, y diseccionar la pared abdominal para exponer completamente cuernos uterinos derecho e izquierdo cada uno conteniendo varios embriones en gestación. Con unas pinzas, mantenga presionado uno de los dos cuernos uterinosy utilizar tijeras para separarla de la mesometrio. Coloque útero diseccionado en hielo en solución salina equilibrada de Hank estéril (HBSS) en una placa de cultivo tisular de poliestireno de 60 mm. Repita para el otro cuerno uterino. Bajo un microscopio de disección estándar de la luz, el uso de fórceps para tirar lejos capa muscular del saco uterino para revelar el saco gestacional subyacente y la decidua. Aislar YS (Figura 2A) retirando suavemente el saco del embrión cerrado. YS extraer tejido del embrión propiamente dicho en el origen embrionario de los vasos vitelinos. Para aislar la AGM, retire el YS y seccionar el embrión por debajo del nivel del corazón y las extremidades anteriores y desechar la región del tórax y la cabeza. A continuación, seccionar el embrión justo por debajo del nivel de las extremidades posteriores y retirar y eliminar el tejido de la cola. Retire las extremidades posteriores y el tejido ventral exceso de la sección restante, que contiene el AGM (Figura 2B). YS piscina o AGM tejidos de embriones múltiples y almacénen hielo en HBSS + (HBSS suplementado con 10% (v) de suero v / bovino fetal y 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 0,3 mg / ml de L-glutamina) en un tubo limpio de 1,5 ml. 3. La digestión del tejido primario en una suspensión de células individuales tubo de centrífuga que contiene YS cosechados o tejidos AGM durante 5 minutos a 2000 xga 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender el tejido en 1 ml de cualquiera de 0,05% (para YS) o 0,2% (para AGM) de colagenasa tipo II diluido en HBSS +. Incubar durante 30 minutos en baño de agua a 37 ° C, invirtiendo el tubo cada 5 minutos para mezclar. Suavemente se disocian mecánicamente el tejido haciendo pasar la muestra 10 veces a través de una pipeta P1000. Si tiene dificultades para aspirar el tejido parcialmente digerido, pipeta de orificio de punta se puede ensanchar cortando ~ 5 mm de la punta con un par de tijeras. Centrifugar la muestra durante 5 minutos a 2000 xga 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y resuspender en 1 ml de hielo frío HBSS +. Pasar a través de una muestra de 70 y# 956; m filtro de células. Recuento de células utilizando un hemocitómetro manual o automatizado. Centrifugar la muestra durante 5 minutos a 2000 xga 4 ° C. muestra Resuspender en DMEM + (4,5 g / L de glucosa de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con 10% (v) de suero v / bovino fetal y 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 0,3 mg / ml de L-glutamina) pre- se calentó a 37 ° C de tal manera que las células se encuentran en una concentración final de 1 x 10 6 células / ml. 4. El tratamiento de las células con Nucleic Acid Dye y etiquetado con fluorescencia con anticuerpos conjugados Alícuota de al menos 100 l de muestra (1 x 10 5 células) en tubos de 1,5 ml frescos para la incubación de anticuerpos. Incluir la siguiente muestra y los tubos de control necesarias: no teñida; solamente cKit-APC; solamente CD45-FITC; solamente CD31-PE; Sólo Flk1-PECy7; Hoechst 33342 solamente; Hoechst 33342 solamente + verapamilo; Muestra (recibe todos los colores, no recibirán verapamilo). Use un mínimo de 1 x 10 <sup> 5 células en 100 l para los tubos de control. Nota: Un volumen más grande de células se puede añadir al tubo de muestra a la misma concentración para maximizar el rendimiento de ordenados Hemogenic CE y HSPC. Agregar verapamilo diluido en etanol al 95% (véase la discusión para justificación) a la "Hoechst 33342 solamente + verapamilo" tubo de control a una concentración final de 50 mM. Incubar todos los tubos durante 5 minutos a 37 ° C. (PRECAUCIÓN: El verapamilo es un agente bloqueador del canal del calcio potente y es extremadamente tóxico Manipular con guantes.). Añadir Hoechst 33342 a la "Hoechst 33342 solamente" control, para el único control Hoechst 33342 + verapamil, y al tubo de "muestra" a una concentración final de 5 mg / ml. Incubar todos los tubos durante 1 hora a 37 ° C, protegido de la luz. Mezclar suavemente por inversión cada 15 minutos. (PRECAUCIÓN: Hoechst 33342 es un colorante nuclear tóxico y debe ser manejado con guantes). Centrifugar todos samples durante 5 minutos a 2000 xga 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender sedimentos de células a una concentración de 1 x 10 5 células / ml en HBSS frío +. Añadir anticuerpos conjugados con fluorescencia a los tubos de control de anticuerpos sólo es apropiado, y al tubo de "muestra" a una concentración final de 2 mg / ml. Incubar en hielo durante 30 min, protegido de la luz. Centrifugar todos los tubos durante 5 min a 2000 xg a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender sedimento celular en HBSS 500 l de hielo frío. muestras de tensión a través del acoplamiento del casquillo del filtro de 5 ml de fondo redondo de tubo de poliestireno FACS y almacenar en hielo, protegido de la luz, por FACS inmediatos. 5. Identificación y Aislamiento de células endoteliales y Hemogenic HSPC por FACS Nota: Este protocolo se ha optimizado el uso de un sistema de BD FACSAria 5-láser equipado con un 100 mw láser UV 355 nm, un 200 mw 405 nm láser violeta, un 200 mw 488 nm láser azul, un 200 mw 532 láser verde nm, y una 150 mw 637 nm rojoláser. Las células se clasifican en PBS estéril como fluido de revestimiento y en condiciones asépticas, y a través de una boquilla de 100 micras con el caudal ajustado a una presión de muestra de 1 de tal manera que un máximo de 1.500 – 2.000 eventos se adquieren por segundo para minimizar el estrés de la célula. En estas configuraciones descritas anteriormente, el uso de tubos de control de color "sin teñir" e individuales para optimizar FACS intensidades láser clasificador de células y realizar control de compensación espectral multi-color de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice dispersión frontal y lateral para realizar células en vivo y doblete de discriminación por parte de los eventos totales (ver las instrucciones del fabricante para más detalles). Nota: Este protocolo da lugar típicamente ~ 70 – 80% de células viables. Si se encuentran problemas con baja viabilidad celular, asegurar que los tejidos se disecan inicialmente rápidamente en hielo medios frío, y que todos los pasos, excepto las que especifican de otra manera se llevan a cabo en hielo, con pipeteo suave para minimizar cizallamiento y muerte celular(Véase la discusión para un mayor detalle en la preservación de la viabilidad celular). Utilice una parcela diferencial lineal escala de Hoechst Rojo contra azul fluorescente Hoechst para identificar la población lateral (SP) eventos (Figura 3A). Utilice el control de "Hoechst 33342 solamente + verapamilo" como un control negativo para verificar que las puertas están correctamente dibujan para la muestra. SP aparecerá como un hombro a la izquierda de las células no-SP, y será disminuido en el control tratado con verapamil. La población no SP se utiliza para identificar no hemogenic CE (Figura 3B). Crear parcelas de fluorescencia diferenciales adicionales (ejes log-escala) y dibujar las puertas de la hija de la SP para identificar las células endoteliales hemogenic (Figura 3C-E). Nota: Las células endoteliales Hemogenic se perfilan como las células Flk1 + / cKit + / CD45- SP (Figura 3D), y HSPC son Flk1- / cKit + / SP células (Figura 3E) CD45 +. C Hemogenic endotelialells se pueden analizar en paralelo con las células endoteliales no hemogenic, que se identifican en este enfoque como células no-SP CD31 + / CD45- (Figura 3B). Recuperar celular endotelial hemogenic o fracción HSPC en metilcelulosa que contiene placas para cultivo hematopoyéticas (véase más adelante), o en otros tampones para el procesamiento y análisis posterior. 6. hematopoyéticas Diferenciación en Cultura Añadir 0,5 ml (135 l / cm 2) hematopoyético cultura de los medios basados ​​en metilcelulosa al número deseado de pocillos de una placa de cultivo tisular de 24 pocillos a temperatura ambiente. Añadir 0,5 ml de agua estéril en los pocillos no utilizados para minimizar la evaporación. Preparar y mantenerla a temperatura ambiente hasta su uso. Ordenar 1 – 10 células para el análisis clonal, o hasta 1.000 células endoteliales hemogenic (Flk1 + / cKit + / células CD45- SP) o (células Flk1- / cKit + / CD45 + SP) HSPC de expansión mayor y la diferenciación directamente en cada pocillo de laplaca que contiene metilcelulosa. La formación de colonias se detecta en aproximadamente el 10-20%. En una campana de cultivo de tejido estéril, utilizar una punta P1000 con la punta recortada para ampliar su diámetro interior, para volver a suspender suavemente cada pocillo de los medios de metilcelulosa cabezas de serie 2 – 3 veces, teniendo cuidado de evitar la creación de burbujas. Esto asegura la suspensión de las células clasificadas en el metilcelulosa semisólida para un crecimiento óptimo. Incubar la placa a 37 ° C con 5% de CO 2 durante un máximo de 2 semanas. Monitor de cultivos de células individuales para la formación de colonias de células hematopoyéticas diferenciadas en el tiempo (Figura 4). Puntuación pozos de número y tipo de colonias hematopoyéticas diferenciadas en los días 1, 3, 7, y 14 por el método (s) se describe a continuación en el paso 6.7. placas de puntuación en el día 1 para confirmar la confluencia y viabilidad de las células clasificadas. El día 3, la verificación de la formación temprana de las colonias de células endoteliales adherentes hemogenic con "adoquinestono de "morfología (ver Goldie et al. 11 y Marcelo et al. 12 para la representación de los días 3 morfología). Por días 5 – 7, comprobar si hay formación de clusters HSPC redondeadas en los pozos que contienen ordenados CE hemogenic. HSPC debe observarse adyacente al aplanado hemogenic CE presentan una morfología celular endotelial "adoquines". Nota: las células endoteliales Hemogenic deben formar colonias hematopoyéticas (determinado por el número de colonias hematopoyéticas), y deben demostrar capacidad de diferenciación multi-linaje (determinado mediante la observación de varios tipos de colonias de una sola célula). Hemos observado anteriormente que ~ 20% de CE hemogenic o HSPC recuperado por FACS sobrevivir para formar la diferenciación y la proliferación de colonias hematopoyéticas en metilcelulosa 11. Para evaluar la formación de colonias por microscopía de fase: Visualizar y contar las colonias a baja magnificación under un microscopio de luz de fase, e identificar BFU-E, CFU-GM y CFU-GEMM colonias de morfología de las colonias, como se describe por Goldie et al. 11. Para evaluar la formación de colonias por la morfología celular: Aspirar colonias individuales de la superficie metilcelulosa en una punta P1000 con el extremo recortado para ensanchar orificio. Esto facilita la aspiración del medio de metilcelulosa viscoso y asegura la recuperación con éxito de la colonia. Resuspender recogió colonias en 200 ml de HBSS y el giro sobre un portaobjetos de vidrio usando una citocentrífuga a 28 xg durante 5 min. Fijar los portaobjetos en metanol al 100% durante 5 minutos (PRECAUCIÓN: El metanol es tóxico y sólo se debe utilizar en una campana química con la ventilación adecuada y equipo de protección personal). Sumergir los portaobjetos en un 0,04% la tinción de Giemsa durante 20 minutos (PRECAUCIÓN:. Tinción de Giemsa contiene metanol puede utilizar en una campana química con la ventilación y la persona apropiadaAl equipo de protección). Enjuague los portaobjetos en agua desionizada. Monte desliza con cubreobjetos, y la imagen en la alta ampliación bajo un microscopio de luz estándar, la comparación de la morfología celular a la observada clásicamente en las células hematopoyéticas de la médula ósea de adultos que se cultivan en medio de metilcelulosa. Para ver ejemplos, consulte las instrucciones del fabricante. Para evaluar la formación de colonias por la expresión de células de los marcadores de linaje hematopoyético por FACS: Añadir 2 ml de HBSS a cada pocillo de una placa de 24 pocillos que contenía las colonias se cultivaron en 0,5 ml de metilcelulosa (es decir, diluir comercialmente disponibles stock metilcelulosa 1: 4). Pipetear arriba y abajo para mezclar y transferir al tubo (s) fresco. la muestra se centrifuga a 2.000 g durante 5 min a 4 ° C utilizando una microcentrífuga de sobremesa estándar. Eliminar el sobrenadante y pellet (s) de células se resuspende en 1 ml de HBSS +, puesta en común de muestras, si así se desea. Centrifumuestra ge a 2000 xg durante 5 min a 4 ° C. Retire sobrenadante y el sedimento (s) celular se resuspende en 400 l de HBSS +. alícuota en cuatro tubos de 1,5 ml como sigue: no teñida; solamente B220-FITC; GR-1-FITC solamente; Ter119-FITC solamente. Añadir anticuerpo fluorescente conjugado al tubo apropiado a una concentración final de 2 mg / ml. Incubar a 37 ° C durante 15 min. Centrifugar la muestra a 2000 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender sedimento celular en helado 0,5 ml de HBSS. Analizar cada muestra mediante FACS para la expresión de cada marcador de linaje hematopoyético: B220 marca las células B 20; GR-1 marcas de células mieloides 21; Ter119 marca células eritroides 22. Nota: anticuerpos adicionales dirigidos otros marcadores de linaje hematopoyético se pueden incorporar en este enfoque, si así se desea.