マウス胚性造血内皮細胞の単離

倫理声明：以下に概説プロトコルはによりレビュー、およびエール大学の施設内動物管理使用委員会のガイドラインに準拠しているされています。 1.全胚卵黄嚢研究例V IVO文化（オプション） E7.0で妊娠中のダムを安楽死させる – E7.5、および（2.4ステップ – 2.7）を以下に詳細に説明するように、無菌条件下で子宮角を除去します。 別々の胚全体（12無傷の卵黄嚢と）脱落膜を周囲から、そして50ミリリットルに50ミリリットルポリスチレンチューブ内の全ラ ​​ット血清を一時停止します。 5％CO 2で3分間ガス胚ボトルはすぐ先12,18について説明しました 。 48時間 – 24のための胚を培養する場合は24時間で、この手順を繰り返します。 最大48時間、37℃で培養液をロールでインキュベートします。 注：胚は（薬理学的物質でex vivoで処理することができる、すなわち 、ノッチ阻害剤DAP。このような因子を含む培地中で最大2時間、またはex vivo培養の全体の長さの圧延培養培地へのこれらの因子の添加を介して胚のプレインキュベーションを介してT 12）、または可溶性タンパク質（ 例えば、フィブロネクチン19）期間。遺伝子発現は、2時間12最適滴定レンチウイルスで胚のプレインキュベーションによって胚で操作することができます。卵黄嚢の血管及び造血発生は、トランスジェニックレポーターマウスおよび光イメージング技術を使用してリアルタイムでモニターすることができます。 マウス胚から卵黄嚢（YS）または大動脈 – 生殖腺 – 中腎（AGM）の2解剖噴霧およびその後の細胞培養物の汚染を減少させるために70％エタノールで全ての表面を拭くことにより、実験台を滅菌。実験台の表面上の吸収性アンダーパッドを配置します。 70％エタノールで手術器具を滅菌します。推奨手術器具は、2＃5ストレート力ですpsの、そして1 8.5センチメートルストレートはさみ。 ex vivoでの培養物からの胚を操作する場合は、慎重に50ミリリットルファルコンチューブから胚全体を削除し、2.8すぐにステップ進みます。それ以外の場合は、このステップをスキップし、2.4に進みます。 適切な胚歳で妊娠中のダムを安楽死させる（E8.5収穫YS場合、E10.5収穫AGM場合）。 注：記載された技術は、デュアル方式の安楽死のアプローチ採用 – 機械頸椎脱臼に続いて揮発性麻酔薬の致死量 – 動物の痛みや苦痛を最小限にするため、および動物被験体の低侵襲性と人間的な終結を確実にするために。訓練を受け、熟練した研究者（：2013年版動物の安楽死のためのAVMAガイドライン）によって実行されたとき、小さなげっ歯類の安楽死のためのこの組み合わせ技術は、米国獣医師会によって推奨されています。 5分- 3のためのイソフルランの致死量（O 2中> 5％）を用いて、マウスを麻酔。 （CAUTION：イソフルランは有毒吸入剤です。適切な呼吸保護具との化学ヒュームフードの下で使用しています。） 立ち直り反射の消失、つま先ピンチ反射の消失、および呼吸数の減少 – – イソフルランへのマウスの曝露後、麻酔レベルの少なくとも3兆候チェックの被験者を確保するための機械的安楽死に進む前に、深い麻酔の平面を達成しています。 Cervically急速に死を誘導するためにダムを脱臼。 アンダーパッド上で安楽死させダム仰臥位を置き、自由に70％エタノールで下腹部をスプレー。 下腹部壁の正中線に沿って縦切開を行います。縦切開の途中から左右に伸びる追加〜1インチ、横切開を行い、完全に左右の子宮角に胚を妊娠し、それぞれ含む複数を公開するために腹壁を離れて解剖。 ピンセットを使用して、2つの子宮角のいずれかを保持しますそして、子宮間膜からそれを分離するためにハサミを使用しています。 60ミリメートルポリスチレン組織培養プレートに滅菌ハンクス平衡塩溶液（HBSS）中で氷上で解剖子宮を置きます。他の子宮角のために繰り返します。 標準の光解剖顕微鏡下では、基礎となる胎嚢と脱落膜を明らかにするために子宮嚢の筋層を引き離すために鉗子を使用しています。静かに囲まれた胚から嚢を除去することにより、YS（ 図2A）を分離します。卵黄血管の胚起源で適切な胚からYS組織を削除します。 AGMを単離するために、YSを削除して、心と前肢のレベル以下の胚を横断し、胸部と頭部領域を捨てます。次に、ちょうど後肢のレベルの下胚を横断し、尾の組織を除去し、廃棄します。 AGM（ 図2B）が含まれ、残りの部分から、後肢および過剰腹側組織を削除します。 複数の胚およびストアからプールYSまたはAGM組織HBSS +中に氷上で清浄な1.5mlチューブに（HBSS、10％（v / v）のウシ胎児血清および100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、および0.3 mg / mlとL-グルタミンを補充しました）。 単一細胞懸濁液への一次組織の3消化 4℃、2,000×gで5分間、収穫YSまたはAGM組織を含む遠心チューブ。 1mlのいずれか（YS用）0.05％HBSS +で希釈したコラゲナーゼタイプII（AGM用）0.2％で上清と再懸濁組織を削除します。混合するために5分ごとにチューブを反転、37℃の水浴中で30分間インキュベートします。 穏やかに機械的にP1000ピペットを介して試料を10回通過させることにより、組織を解離します。難易部分的に消化された組織を吸引した場合は、ピペットチップの穴がハサミで先端の〜5ミリメ​​ートルを切断することによって広げることがあります。 4℃で2000×gで5分間遠心サンプル。 1ミリリットルの氷冷HBSS +で上清と再懸濁を削除します。 70を介してサンプルを渡し＃956; m個のセルストレーナー。 手動または自動血球計数器を用いて細胞を数えます。 4℃で2000×gで5分間遠心サンプル。 DMEM中で再懸濁した試料は、+プレ（4.5グラム/ Lのグルコースのダルベッコ改変イーグル培地、10％（v / v）のウシ胎児血清および100 U / mlのペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、および0.3 mg / mlとL-グルタミンを補充しました）細胞を1×10 6細胞/ mlの最終濃度になるように37℃に温めました。 蛍光標識抗体と核酸色素とラベリングを有する細胞の4.治療抗体インキュベーションのための新しい1.5mlチューブに小分けしたサンプルの少なくとも100μlの（1×10 5個の細胞）。 次のサンプルや必要な制御チューブ含める：未染色を、 CKIT-APCのみ。 CD45-FITCのみ。 CD31-PEのみ。 Flk1-PECy7のみ。ヘキスト33342のみ。唯一のベラパミルを+ヘキスト33342;サンプル（すべての色を受け取り、ベラパミルを受信しません）。 1×10の最小値を使用します<sup>コントロールチューブ用100μl中5細胞。 注：細胞の大容量をソート造血EC及びHSPCの収率を最大にするために、同じ濃度のサンプル管に添加してもよいです。 "のみ+ベラパミルヘキスト33342」コントロールチューブ、50μMの最終濃度を95％エタノールで希釈したベラパミル（根拠のための説明を参照）を追加します。 37℃で5分間、すべてのチューブをインキュベートします。 （ 注意：ベラパミルは強力なカルシウムチャネル遮断剤であり、非常に毒性が手袋をして取り扱ってください。）。 5μg/ mlの最終濃度にヘキスト33342 +ベラパミルのみのコントロールに、「ヘキスト33342のみ」コントロールにヘキスト33342を追加し、「サンプル」チューブに。光から保護し、37℃で1時間、のためにすべてのチューブをインキュベートします。ゆっくり15分毎に転倒混和。 （ 注意：ヘキスト33342は、毒性の核色素であり、手袋で処理する必要があります）。 遠心分離すべてのSAMPレ4℃で2000×gで5分間。上清を除去し、冷HBSS +で1×10 5細胞/ mlの濃度で細胞ペレットを再懸濁します。 2μg/ mlの最終濃度に適切な抗体のみの対照管に、および「サンプル」の管に蛍光標識抗体を追加します。光から保護して30分間、氷上でインキュベートします。 4℃で2000×gで5分間遠心分離はすべてのチューブ。上清を除去し、500μlの氷冷HBSSで細胞ペレットを再懸濁します。即時FACS用の光から保護氷上で5ミリリットルのメッシュフィルターキャップ丸底ポリスチレンFACSチューブや店舗を通じてひずみサンプル、。 FACS 5.同定および造血内皮細胞の単離およびHSPC 注：このプロトコルは、100 MW 355 nmのUVレーザーを搭載したBD FACSARIA 5-レーザーシステム、200 MW 405nmの青紫色レーザ、200 MW 488nmの青色レーザー、200 MW 532nmのグリーンレーザを用いた最適化された、としました。 150 MW 637 nmのレッドレーザ。細胞が、シース流体として無菌条件下で滅菌PBSにソートし、そしてサンプルの圧力に設定流量で100μmのノズル1〜1,500の最大よう – 2,000イベントが細胞ストレスを最小にするために毎秒取得されます。 上記のこれらの設定の下では、FACSセルソーターのレーザー強度を最適化し、製造業者の説明書に従って、マルチカラースペクトル補償制御を実行するために、「未染色」と単色制御管を使用しています。 （詳細については、製造元の手順を参照してください）​​総イベントから生細胞とダブレット差別を実行するために、前方使用および側方散乱。 注：このプロトコルは、通常、〜70になる – 80％生存細胞。問題は、低細胞生存率で発生した場合は、組織が最初に氷冷メディアに迅速に解剖されていることを確認し、そうでない場合は指定するものを除くすべてのステップは、せん断および細胞死を最小限にするために穏やかにピペッティングして、氷上で行われていること（細胞生存率を維持する上で、より詳細のための議論を参照してください）​​。 サイドポピュレーション（SP）イベント（ 図 3A）を識別するためにヘキストブルー蛍光対ヘキストレッドの差動リニアスケールのプロットを使用してください。ゲートが適切にサンプルのために描かれていることを確認するために、陰性対照として「ヘキスト33342のみ+ベラパミル」コントロールを使用します。 SPは、非SP細胞の左に肩のように表示され、ベラパミル処理の対照に減少するであろう。非SP集団は、非造血EC（ 図3B）を識別するために使用されます。 追加の微分蛍光プロット（対数スケールを軸）を作成し、造血内皮細胞（ 図3C-E）を識別するために、SPの娘ゲートを描きます。 注：造血内皮細胞はのFlk1 + / CKIT + / CD45 – SP細胞（ 図3D）として、プロファイル、およびHSPCはFlk1- / CKIT + / CD45 + SP細胞（ 図 3E）されています。造血内皮CellsはCD31 + / CD45-非SP細胞（ 図 3B）、このアプローチで同定される非造血内皮細胞と並行して分析することができます。 （下記参照）造血培養のためのプレートを含むメチルセルロース上に造血内皮細胞またはHSPC画分を取得し、又はその後の処理および分析のために他のバッファへ。 文化6.造血分化室温で24ウェル組織培養プレートのウェルの所望の数の0.5ミリリットル（135μL/ cmの2）メチルセルロース系造血培地を加えます。蒸発を最小限に抑えるために、未使用のウェルに0.5ミリリットルに滅菌水を追加します。新鮮な準備、使用するまで室温で保管してください。 ソート1から10の細胞クローン解析のために、または最大1,000造血内皮細胞（のFlk1 + / CKIT + / CD45 – SP細胞）の各ウェルに直接バルクの拡大と分化のためまたはHSPC（Flk1- / CKIT + / CD45 + SP細胞）メチルセルロースを含むプレート。 20％ – コロニー形成は、約10で検出されます。 泡の生成を避けるように注意しながら、3回 – 滅菌組織培養フードでは、静かにシードされたメチルセルロースメディアの2を、各ウェルを再懸濁し、その穴を広げるためにトリミングされた先端を有するP1000チップを使用します。これは、最適な成長のための半固体メチルセルロースにソート細胞の懸濁液を保証します。 2週間まで、5％CO 2、37℃でプレートをインキュベートします。 時間をかけて、分化した造血細胞コロニーの形成（ 図4）のための単一の細胞培養物を監視します。 1日目、3、7で数および分化した造血コロニーのタイプのための井戸をスコアし、ステップ6.7で以下に概説する方法（複数可）による14。 1日目にスコアプレートは、選別された細胞の密集度と継続的な生存能力を確認しました。 3日目では、「丸石との接着性造血内皮細胞コロニーの早期形成をチェックトーン」形態（一日3形態の表現のためのゴールディら 11とマルセロら 。12を参照してください）。 日5によって – 7、ソートされた造血ECを含むウェルに丸みを帯びたHSPCクラスターの形成のために確認してください。 HSPCは「丸石」内皮細胞の形態を示す造血ECを平坦化するために、隣接する観察されるはずです。 注：造血内皮細胞（造血コロニー数によって決定される）、造血コロニーを形成すべきである、と（単一の細胞から複数のコロニータイプの観察により決定）多系列分化能を実証する必要があります。我々は以前、FACSによって取得造血ECまたはHSPCの〜20％がメチルセルロース11における造血コロニーを分化し、増殖して形成するために生き残ることを観察しました。 位相差顕微鏡によるコロニー形成を評価するには： 視覚化し、低倍率ウントでコロニーを数えます位相光顕微鏡えー、とゴールディら 11によって記載されているように、コロニー形態によりBFU-E、CFU-GM、およびCFU-GEMMコロニーを識別します。 細胞の形態によるコロニー形成を評価するには： 端とP1000の先端にメチルセルロース表面から吸引し、個々のコロニーを、穴を広げるようにトリミング。これは、粘性メチルセルロース培地の吸引を容易にし、コロニーの正常な取得を保証します。 再懸濁し、5分間、28×gで細胞遠心を使用して、スライドガラス上に200ミリリットルのHBSSとスピンにコロニーを選びました。 5分間、100％メタノール中でスライドを修正しました。（ 注意：メタノールは有毒であり、唯一の適切な換気と個人用保護具と化学フード内で使用する必要があります）。 20分（ 注意のために0.04％ギムザ染色でスライドを浸し：ギムザ染色はメタノールを含む適切な換気と人との化学フード内で使用してくださいアル保護具）。 脱イオン水でスライドを洗浄します。 マウントは、古典的メチルセルロース培地中で培養され、成人の骨髄から造血細胞で観察されたものと細胞の形態を比較すると、標準的な光学顕微鏡の下で高倍率でカバースリップ、および画像とスライド。例については、製造元の指示を参照してください。 FACSによって造血系統マーカーの細胞発現によりコロニー形成を評価します： 0.5 mlのメチルセルロースに培養されたコロニーを含む24ウェルプレートの各ウェルに、HBSS 2 mlを加え（ すなわち、商業的に入手可能な在庫メチルセルロース1を希釈：4）。アップピペットとミックスダウンすると、新しいチューブ（単数または複数）に移します。 標準的な卓上型マイクロ遠心を用いて、4℃で5分間、2000×gで遠心分離サンプル。 上清を除去し、1ミリリットルHBSS +で細胞ペレット（複数可）を再懸濁し、必要に応じてサンプルをプールします。 Centrifu4℃で5分間、2000×gでGEサンプル。 上清を除去し、400μlのHBSS +で細胞ペレット（複数可）を再懸濁します。 4 1.5ミリリットルチューブにアリコート試料を次のように未染色を、 B220-FITCのみ。 GR-1-FITCのみ。 TER119-FITCのみ。 2μg/ mlの最終濃度になるように適切な管に蛍光標識抗体を加えます。 15分間37℃でインキュベートします。 4℃で5分間、2000×gで遠心分離サンプル。上清を除去し、氷冷0.5ミリリットルHBSSで細胞ペレットを再懸濁します。 各造血系マーカーの発現についてFACSにより各サンプルを分析：B220はB細胞20をマーク。 GR-1マーク骨髄細胞21。 TER119は、赤血球細胞22をマークします。 注：必要に応じて他の造血系統マーカーを標的とする追加の抗体は、このアプローチに組み込むことができます。