代謝表現型が異なる未熟、熟女と寛容原性樹状細胞の生成

この研究は施設内倫理委員会（NUS-IRB 10〜250）によって承認されました。 末梢血単核細胞（PBMC）の単離1。 試薬の調製 PBS / EDTA調製：リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を2 mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）で補います。 0.2μmのフィルターを通して濾過することにより、このソリューションを滅菌します。 4℃でPBS / EDTAを格納するために注意し、使用前に室温に温めます。 染色バッファを準備し、2％ウシ胎児血清（FBS）を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）サプリメント、10mMの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、および2mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）。 0.2μmのフィルターを通して濾過することにより、このソリューションを滅菌します。 ブラッドコーンから血液を採取 注：血液コーンプレート後に採取白血球成分を含みます病院からletpheresis。血液は、ヘパリンまたはEDTAチューブに回収された場合、1にPBSで血液を希釈：1比および1.3に進みます。バフィーコートを受信した場合、1にPBSでバフィーコートを希釈：2の比率と1.3に進みます。 血液を50 mlチューブに流出することを可能にする円錐形の2つの端部を切断します。コー​​ンは、通常、血液の10ミリリットルが含まれていることに注意してください。 コー​​ンを洗浄し、50 mlチューブに収集するために、PBS / EDTAの30ミリリットルを含む平滑末端注射器を使用してください。 80ミリリットルの最終容量までさらにPBS / EDTAで血液を希釈します。 密度遠心分離 16 によるPBMCの単離 アリコート15ミリリットル4新しい50 mlチューブにフィコールそれぞれ。 フィコール層の上に希釈血液の20ミリリットルを追加するために25ミリリットルに血清学的ピペットを使用してください。 45角度で50mlのチューブを保持し、相間を乱さないように世話をするために注意してください。 30分、20°Cのためにブレーキなしで805×gでチューブを遠心。 削除します血漿層とちょうどパスツールピペットでプラズマ層の​​下に横たわっているPBMCのリングを収集します。 2 50ミリリットルチューブにPBMCの4つのチューブを兼ね備えています。 PBMCを、以下の透明層の収集を回避することができてください。 10分、20°Cのためにブレーキ付き548×gでのPBMCのチューブと遠心分離機あたり50 mlの最終体積にPBS / EDTAを追加します。 染色緩衝液の25ミリリットルと各チューブ内の上清を吸引し、ペレットを再懸濁し、1 50mlのチューブにまとめます。 5分、4°C用ブレーキ付き367×gで遠心分離します。 染色緩衝液の10ミリリットルで上清を吸引し、ペレットを再懸濁し。 磁気分離17 2.単球濃縮 細胞数を決定します PBMC細胞懸濁液20μLを取り、サイトメーター使用して、生細胞の数をカウントするためにトリパンブルーを20μlと混合。 ブレーキ付き367×gで遠心し細胞懸濁液10分、4°Cのために。 染色緩衝液80μlのあたり10 7細胞の濃度に完全に上清を吸引し、再懸濁細胞ペレット。 磁気標識 、10 7個の細胞あたりのCD14マイクロビーズの20μl加えよく混ぜると2で15分間インキュベート- 8°C。 10分間ブレーキ付き367×gで10 7細胞および遠心分離、4°Cあたりの染色緩衝液の1ミリリットルを追加することによって、細胞を洗浄。 完全に上清を吸引し、染色緩衝液50μlあたり10 7細胞の濃度で再懸濁細胞ペレット。 磁気分離 2×10 8の全細胞の最大のための中型の列を使用します。 注：全細胞の数とデータシートで推奨されるCD14 +細胞の数に応じて適切な列と区切り文字を選択してください。 磁場Oで列を配置faの適切なセパレータと染色緩衝液500μlですすぐことにより、カラムを準備します。 カラムにピペットで細胞懸濁液と15mlチューブにカラムを通過する非標識細胞を収集します。 列の下に新しい15ミリリットルチューブを交換し、染色緩衝液500μlでカラム3回洗浄します。コラムリザーバは洗浄の間に新たな染色バッファーを追加する前に空であることを確認してください。 セパレーターから列を削除し、新鮮な15mlチューブの上に置きます。 ピペットカラムに染色緩衝液1ml。すぐにしっかりとカラムに（キットで提供）プランジャーを押すことによって、磁気標識細胞を洗い流します。 繰り返しは、CD14 +細胞の純度を高めるために新しいカラム上での溶出画分を使用して、2.3.6に2.3.2を繰り返します。ビーズがステップ3.2の間に文化の中で自動的に細胞から放出されることに注意してください。 別のアクティベーションSへの樹状細胞の分化3.tates 試薬の調製（エンドトキシンレベルは、すべての試薬 ​​で0.1 EU / ml未満である必要があります） 細胞培養培地を準備する：RPMI 1640、10％ウシ胎児血清（FBS）、1％非必須アミノ酸（NEAA）および0.05 mMの2-メルカプトエタノール（2ME）を補充しました。 0.2μmのフィルターを通して濾過することにより、このソリューションを滅菌します。 サイトカインの準備：0.25ミリグラム/無菌条件下でそれぞれmlの濃度に細胞培養グレードの水中でIL-4およびGM-CSFを再構成します。 -80℃で200μlのマイクロ遠心チューブとストアにアリコートサイトカイン。 ビタミンD3の株式を準備します。無菌条件下で100 mMの濃度に細胞培養グレードの水にビタミンD3を再構成。一定分量のビタミンD3、-20℃で1.5 mlマイクロチューブやストアに。 デキサメタゾンの株式を準備し、無菌条件下で10 mMの濃度に細胞培養グレードの水にデキサメタゾンを再構成します。アリコートdexamet-20℃で1.5 mlマイクロチューブにhasOneのとストア。 LPSを準備：無菌条件下での1mg / mlの濃度に細胞培養グレードの水中のリポ多糖（LPS）を再構成します。アリコート1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにLPSおよび-20°Cで保存。 異なるたMoDCの生成 シード0.3の濃度でCD14 +単球の4セット- GM-CSFを200 ng / mlで6ウェルプレート中のIL-4の200 ng / mlで用いて補充した細胞培養培地の0.5×10 6 / mlです。これは0日と各6ウェル中の培地の体積で2ミリリットルであることに注意してください。 5％CO 2で37℃組織培養インキュベーター中で細胞をインキュベートします。 5分、4℃、300×gで4日目と遠心で培養液から培地850μLを削除します。吸引上清および（GM-CSFを200 ng / mlで、およびIL-4の200 ng / mlで）の2倍を含有する細胞培養培地1mlで再懸濁ペレット。バックこの細胞混合物を追加します。文化へ。培地1mlバック培養物に添加した場合の濃度は、GM-CSFおよびIL-4のために加え、その2倍が1倍になるであろう注意。 免疫寛容誘発したMoDCを生成するために、5日目のセットのうちの2つにビタミンD3ストックと培地1ml当たりデキサメタゾンストック1μlの1μLを加えます。ビタミンD3の最終濃度は10 nMで100 nmおよびデキサメタゾンであることに注意してください。 GM-CSFおよびIL-4の添加は、5日目には必要とされません。 6日目に、すべてのセットにGM-CSFの200 ng / mlでおよびIL-4の200 ng / mlでを追加します。 成熟したMoDCを生成するために、6日目でのみ、GM-CSFおよびIL-4で処理されたセットのいずれかにLPS1μg/ mlのを追加します。 LPS-寛容原性のMoDCを生成するために、6日目での寛容原性のMoDCの1セットにLPSを1μg/ mlのを追加します。 フローサイトメトリーまたは他の研究のために、PBS、EDTAで培養皿を洗浄することにより7日目のMoDCの異なる種類を収穫。唯一の非接着細胞を採取することに注意してください。注意CD14 + monocからの収率％を取ります未成熟MoDCを、成熟MoDCを、寛容原性のMoDCおよびLPS寛容原性DCのytesは、​​それぞれ約90％、50％、60％、60％であり、血液ドナー及びFBSロット間で変化します。 4.フローサイトメトリー たMoDC上の細胞表面マーカーのキャラクタリゼーション ピペッティングにより培養皿から細胞を取り外します。 1.5ミリリットルマイクロチューブに染色緩衝液50μl当たり5×10 5細胞の濃度でPBS / EDTAを再懸濁細胞で細胞を1回洗浄します。 PerCPを共役HLADR（1：100）で0.5×10 6細胞のアリコートをインキュベートし、PE結合CD80（1：50）、PE結合CD83（1：25）、PE結合CD86（1：50）、APC-共役のCD11c（1時50分）、PE結合CD14（1時50分）およびPE結合BDCA3（1時50分）と4℃で30分間、暗所でAPC結合ILT3（1時25分）。アイソタイプが一致したPerCPをコンジュゲートモノクローナル抗体（1時20）、PE結合モノクローナル抗体（1：11）、APC結合モノクローナル抗体（1:11）ネガティブコントロールとして機能します。 18フローサイトメーターを使用して、表面マーカーの発現レベルを検出します。 たMoDCのミトコンドリア膜電位の分析 凍結乾燥レッドCMXRosの50μgのあたりにジメチルスルホキシド（DMSO）の94.1μLを添加することにより、1 mMのレッドクロロ-X-rosamine（CMXRos）のストック溶液を準備します。 15 mlのチューブ内で37℃で30分間、ハンクス平衡塩溶液（HBSS）1ml中100 nMの赤CMXRosで2×10 5のMoDCインキュベートします。 5分間、室温、300×gで細胞や遠心分離機にPBS / EDTAの2ミリリットルを追加します。 2回繰り返します。上清を吸引し、フローサイトメトリー分析のためにPBS、EDTA、2％FCS300μlの中に再懸濁細胞ペレット。レッドCMXRos信号を分析するために、PEチャンネルを使用するように注意してください。 T細胞のマーカーの特徴付け 1.2×10 6 CFSE標識CD4 + T細胞アロ（から生成された50μlのをインキュベート200）、PE / Cy7の共役CD4（1：400）およびAPC / Cy7の抱合CD25（1：4℃で30分間、暗所で100）PerCPをコンジュゲートCD3（1とステップ5.6）。室温で1時間、暗所でのFoxp3、アレクサフルオロ647（1:50）を用いて、市販のキットを用いて染色T細胞。 5. Alloreaction研究製造業者のプロトコールに従って、凍結乾燥CFSEにDMSO 18μLを添加することによって、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）の5mMのストック溶液を調製します。 PBMCからCD4 + T細胞を精製 PBMC細胞懸濁液の20μlのを取ることによって細胞数を決定し、サイトメーターを用いて、生細胞の数をカウントするためにトリパンブルーを20μlと混合。 10分間ブレーキ付き367×gで、4℃で遠心し細胞懸濁液。 完全に上清を吸引し、5ミリリットルpolystyで染色緩衝液の1ミリリットル当たり5×10 7細胞の濃度で再懸濁細胞ペレットルネチューブ。 50μl/ mlの細胞にヒトCD4 + T細胞濃縮カクテルを追加します。よく混合し、室温でインキュベート – 10分間（15〜25°C）。 ボルテックス磁性粒子30秒間そして100μl/ mlの細胞で磁性粒子を追加します。よく混合し、室温で5分間インキュベートします。 2.5ミリリットルの全体積に細胞懸濁液に染色バッファーを追加します。 3回 – そっと2をピペッティングによりチューブ内の細胞を混ぜます。磁石にチューブを置き、5分間インキュベートします。 チューブと反転磁石と新しい5mLのポリスチレンチューブに（T細胞を含む）、懸濁液をデカント。 細胞数を決定し、光から保護し、37℃で20分間、1mlのPBSに5μMのCFSEで1.2×10 6 CD4 + T細胞を培養します。 細胞に（ステップ3.1.1に従って調製）の細胞培養培地の5倍の染色容積を加え、5分間インキュベートします。 Centrif75μlの当たり2×10 5の濃度で細胞培養培地中で5分間、4℃、ペレットを再懸濁し、300×gでUGE。 0と細胞培養培地の75μLを含む各MODC培養液に2×10 5 CFSE標識CD4 + T細胞の75μlを添加し、2.5×10 3、5×10 3、10×10 3、20×10 3と96ウェルU底プレート中で40×10 3のMoDC。 5％CO 2で37℃組織培養インキュベーター中で6日間培養。 5分、4℃、300×gで15ミリリットルチューブと遠心分離機にCD4 + T細胞をピペットにより収穫。サイトカイン分析のために上清を収集し、4℃で5分間、300×gで2 PBS / EDTA mlの遠心分離で細胞ペレットを再懸濁します。 6.サイトカイン分析19 ステップ5.5で説明したようにalloreaction研究からの上清を収集します。 ヒトサイトカイン/ Chemokinのための試薬 ​​の調製電子磁気パネル分析ビーズの個々のバイアルのための抗体固定化ビーズのボトルを混合の調製のために、1分間ボルテックスを（キットに含まれます）。 （キットに含まれる）ミキシングボトルに各抗体ビーズバイアルから60μlを添加して、ビーズ希釈剤で3ミリリットルの最終容量にもたらす（提供）。 品質管理の調製のために、250μlの脱イオン水を用いて品質管理1及び品質管理2（キットに含まれる）を再構成します。 洗浄バッファーの調製のために、脱イオン水270ミリリットルで（キットに含まれる）10×洗浄緩衝液の30ミリリットルを希釈します。 ヒトサイトカインスタンダードの調製のために、万pg / mlでの濃度を得るために、250μlの脱イオン水で（キットに含まれる）は、ヒトサイトカイン標準を再構成します。 2000 pg / mlでの作業標準を作るために1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ中（キットで提供される）アッセイ緩​​衝液200μlに万pg / mlでヒトサイトカインの標準の50μLを追加。 400 pg / mlでの作業標準を作るために1.5ミリリットルマイクロチューブ中（キットで提供される）アッセイ緩​​衝液200μlに転送2,000 pg / mlでヒトサイトカインの標準50μlの。 転送1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ中（キットで提供される）アッセイ緩​​衝液200μlに400 pg / mlでヒトサイトカインの標準の50μlを80 pg / mlでの作業標準を作ります。転送1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ中（キットで提供される）アッセイ緩​​衝液200μlに80 pg / mlでヒトサイトカインの標準の50μlを16 pg / mlでの作業標準を作ります。 転送3.2 pg / mlでの作業標準を作るために1.5ミリリットルマイクロチューブ中（キットで提供される）アッセイ緩​​衝液200μlに16 pg / mlでヒトサイトカインの標準50μlの。 0 pg / mlでの作業標準を1.5 mlのマイクロ遠心チューブ内のアッセイ緩​​衝液のみを200μlのを持っています。 フィルタの各ウェルにアッセイ緩​​衝液（提供）の200μLをピペッティングすることにより（キットに含まれる）前の湿式フィルタープレートプレート。室温で10分間プレートシェーカー上にフィルタープレートをシールし、配置します。 吸引除去アッセイ緩​​衝液および適切なウェルに各標準または品質管理の25μlを添加します。 背景、規格および対照ウェルに（ステップ3.1.1に従って調製）細胞培養培地25μlのを追加します。 サンプルウェルに25μLのアッセイ緩​​衝液を追加し、適切なサンプルウェルにサンプルの25μlを添加します。 ボルテックス混合ボトル抗体固定化ビーズを含有し、各ウェルに混合ビーズの25μlを添加します。プレートをシールし、4℃で一晩プレートシェーカー上で攪拌しながらインキュベートします。 吸引し、流体および洗浄緩衝液200μl/ウェルを添加し、流体を吸引することにより、プレートを2回洗浄します。 各ウェルに検出抗体（提供）の25μlのを追加します。密封し、室温で1時間プレートシェーカー上で攪拌しながらインキュベートします。 ストレプトアビジンフィコエリトリン（プロブ25μlのを追加各ウェルの検出抗体25μlのを含有することにIDED）。密封し、室温で30分間、プレートシェーカー上で攪拌しながらインキュベートします。 ステップ6.8で説明したように吸引液および洗浄プレート。 150μL/ウェルの5分間プレートシェーカー上の全てのウェルを再懸濁ビーズにシース液を追加します。 3Dシステム20を使用して、ビーズの蛍光強度を検出します。サンプル21におけるサイトカイン/ケモカインの濃度を計算するための5つのパラメータログロジスティック曲線フィッティング法を用いて、蛍光強度中央値のデータを分析します。 7.リアルタイム酸素消費速度（OCR）および細胞外酸性化率（ECAR）の測定 試薬/材料の作製 OCRの培地を調製：25mMのグルコース及び1mMピルビン酸ナトリウム（pHは7.35）を補充したアッセイ培地。 0.2μmのフィルターを通して濾過することにより、このソリューションを滅菌します。この媒体は広報であることをメモしておいてくださいFBS中の成分が複雑で、葯のロットに1ロットごとに異なる​​ので、FBSを含まないepared。 ECAR媒体を準備します。培地2 mMのL-グルタミン（pHは7.35）を補ったベース。 0.2μmのフィルターを通して濾過することにより、このソリューションを滅菌します。この媒体は炭酸水素塩、グルコース、ピルビン酸およびFBSなしで調製されていることに注意してください。 FBSは、緩衝能を有しており、ECARの読み取りを妨害することに注意してください。 OCRの測定のための化合物を調製した：100μMの原液を作成し、作業濃度16μMにOCR培地で希釈するOCR媒体の630μlのオリゴマイシン再懸濁します。 100μMの原液を作成し、作業濃度4.5μMにOCR培地で希釈するOCR媒体の720μlの再懸濁シアン化カルボニル、4-（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（FCCP）。 50μMストック溶液を作成し、作業濃度10μMのOCR培地で希釈するOCR媒体の540μlのとロテノン/アンチマイシンAを再懸濁します。 準備しますECAR測定のための化合物：ECAR培地3mlで再懸濁グルコース100 mMストック溶液を作製し、80 mMの作業濃度に希釈します。 100μMの原液を作成し、作業濃度18 mMのに希​​釈するECAR媒体の720μlのオリゴマイシン懸濁します。 ECAR培地1.5mlで再懸濁し、2-デオキシ-D-グルコース1,000 mMのストック溶液を作製しました。 測定前に無CO 2 1日と37℃でのカートリッジ及び店舗の各ウェルに、較正のピペットで200μlの。 リアルタイムのOCR測定 収穫したMoDCとOCR培地を150μlあたり60×10 3の濃度でOCR媒体でのMoDCの各タイプを再懸濁します。 シード60×10 3細胞/ウェルのポリ-D-リジンでコーティングした96ウェル平底プレート中で、37℃で1時間、非CO 2インキュベーター中でインキュベートします。 1時間コートにポリ-D-リジンの50 ng / mlでプレートの50μLを使用して洗浄す​​ることに注意してください滅菌水。使用前に室温で2時間プレートをぬらさないでください。 ピペットすべてのウェルについての注入ポートAに25μlのOCR媒体。すべてのウェルのための注入口Bにおけるオリゴマイシンの16μMを含む25μlのOCR媒体。すべてのウェルのための注入口Cと全てのウェルのための注入口D中10mMロテノン/アンチマイシンAを含む25μlのOCR培地（FCCP）の4.5μMを含む25μlのOCR媒体。オリゴマイシンの最終的なウェル濃度が2μMであることに注意してください、FCCPは0.5μMであり、ロテノン/アンチマイシンAは1μMです。 細胞外フラックス分析装置にプレートを置き、4つの連続した​​段階で同時に全てのMoDCとの完全なOCRの研究を実行します。基礎呼吸を、（ポートBから薬物注射後の）ミトコンドリア複合体V阻害、最大呼吸誘導（ポートAからの培地の注射後）（後ポートCから薬物注射）とポートDからの薬物後の電子輸送チェーンの阻害（）22。 3 Cがあることにご注意ください注射と測定値の間の6分間隔の間でycles。 リアルタイムECAR測定 収穫したMoDCとECAR培地を150μlあたり60×10 3の濃度でECAR媒体でのMoDCの再懸濁し、各タイプ。 種子6×10 4細胞/ウェルのポリ-D-リジンでコーティングした96ウェル平底プレート中で、37℃で1時間、非CO 2インキュベーター中でインキュベートします。 すべてのウェルのための注入口Aにピペット25μlのECAR媒体。すべてのウェルについての注入ポートB中のグルコースを10mMを含有する25μlのECAR媒体。すべてのウェルのための注入口Cと全てのウェルのための注入口D 1,000 mMの2-デオキシ-D-グルコースを含む25μLOCR媒体にオリゴマイシンの18μMを含む25μlのECAR媒体。注グルコースの最終的なウェル濃度は10μMであることを、オリゴマイシンは、2μMと2-デオキシ-D-グルコースは100mmです。 細胞外フラックス分析装置にプレートを置き、実行4つの連続した​​段階で、同時にすべてのMoDCとの完全なECARの研究：基礎（ポートAからの培地注射後）呼吸、（ポートBから薬物注射後の）解糖誘導、（ポートCから薬物注射後の）最大の解糖誘導および解糖阻害（後ポートD）22からの薬剤。 テューキーの多重比較事後テストで一方向ANOVAを用いて統計的差異を分析します。