Creazione di una configurazione high-throughput screening per piccole molecole che modulano c-di-GMP Segnalazione di<em> Pseudomonas aeruginosa</em

Nota: Le procedure per la clonazione e la trasformazione del purificato c-di-GMP giornalista plasmide sono discussi altrove 12. 1. Generazione di GFP Tagged c-di-GMP Reporter P. aeruginosa Strain Seminare medio 5 ml di brodo lisogenia (LB) con una singola colonia di P. aeruginosa e incubare durante la notte a 37 ° C con agitazione a 200 rpm. Trasferimento 2 ml di coltura durante la notte in 200 ml di terreno LB fresco in un pallone da 1 L e incubare a 37 ° C con agitazione a 200 rpm. Monitorare densità ottica a 600 nm (OD 600) ogni 30 min prelevando un campione 1 ml dalla muffola ed esaminare utilizzando uno spettrofotometro (come descritto in precedenza 12). Quando la OD 600 raggiunge tra 0,3 – 0,5 porre 40 ml di coltura in un tubo da 50 ml conica per centrifuga. Agglomerare le cellule per centrifugazione a 8.000 rpm per 10 min a 4 ° C, scartare il surnatante e re-sospensione le cellule in 40 ml di soluzione 300 mM di saccarosio ghiacciata, sterile. Agglomerare le cellule una seconda volta mediante centrifugazione come descritto al punto 1.5 e risospendere in 20 ml di soluzione da 300 mm di saccarosio ghiacciata, sterile. Agglomerare le cellule per l'ultima volta per centrifugazione come descritto al punto 1.5 e risospendere in 400 ml di soluzione da 300 mm di saccarosio ghiacciata, sterile. Nota: La densità delle cellule, a questo punto dovrebbe essere di circa 1 x 10 11 unità formanti colonia per millilitro (CFU / ml). Raffreddare le cellule in ghiaccio per 30 min, dopo di che sono pronti per l'elettroporazione. Aggiungere 1 ml di una / ml pCdrA :: GFP C plasmide 12 soluzione 0,2 mg a 40 ml di P. cellule elettro-competente aeruginosa preparati sopra in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga che è stato pre-raffreddata in ghiaccio. Mescolare la sospensione e trasferire in un pre-raffreddata, 2 millimetri distanza tra gli elettrodi, elettroporazione provetta. Nota: pCdrA :: GFP </em> C: pUCP22Not-P CDRA -RBSII- GFP (MUT3) -T 0 -T 1, Amp r Gm R, che dà una lettura a fluorescenza del livello intracellulare di c-di-GMP in P. ceppi aeruginosa, è stato sviluppato e validato da Rybtke et al. 12. Rimuovere l'umidità all'esterno della cuvetta con carta velina e posizionare la cuvetta nella camera del campione del electroporator. Pulse con una tensione di 2,5 kV, capacità di 25 uF e resistenza di 200 Ω. Rimuovere la cuvetta e aggiungere 1 ml di terreno LB. Quindi, trasferire le cellule ad una sterile 1,5 ml provetta e incubare per 2 ore a 37 ° C con agitazione a 200 rpm. Distribuire 10 ml, 50 ml e aliquote di 100 microlitri della coltura su piastre LB-agar addizionato con ampicillina sterili (ad una concentrazione di 100 ug / ml), e incubare le piastre a 37 ° C durante la notte. Confermare l'espressione GFP (excitatisu a 485 nm, emissione a 520 nm), esaminando la lastra sotto un microscopio a fluorescenza con un canale GFP normale e scegliere una singola colonia per inoculare 5 ml LB. Incubare per una notte come descritto al punto 1.1. Mescolare 0,5 ml della coltura durante la notte con 0,5 ml di glicerolo al 50% in 2 ml vite tubo orizzontale e conservare a -80 ° C. 2. Preparazione della coltura starter per l'inoculazione Due giorni prima che lo schermo, il piatto del P. ceppo aeruginosa (contenente la pCdrA :: GFP C plasmide) da -80 ° C archivio su una piastra di LB-agar (integrato con ampicillina ad una concentrazione di 100 ug / ml), diffondendo delicatamente i batteri sopra la piastra utilizzando un inoculo sterile ciclo continuo. Incubare la piastra per una notte a 37 ° C. La sera prima della proiezione, inoculare una singola colonia di P. aeruginosa dalla piastra in 10 ml di terreno LB (integrato con ampicillina ad una concentrazione di 100 ug / ml) in una TUessere e incubare durante la notte pre-coltura a 37 ° C con agitazione a 200 rpm. Il giorno della schermata, preparare una subcoltura dal overnight precoltura diluendo prima con terreno LB fresco ad una OD 600 di 1,0 e poi ulteriormente diluito con 5% LB ad un OD 600 di 0,04 (rapporto 1,25) . Nota: Il volume totale del mezzo inoculato dipende dal numero di piastre da testare. 5% LB è fatta diluendo 100% LB con tampone fosfato (PBS) alla concentrazione desiderata. È importante sottolineare che i media (5% LB) consente l'attivazione costitutiva della pCdrA :: GFP C in P. aeruginosa. Aggiungere sterile ancoretta magnetica nel contenitore e mescolare la coltura a velocità minima su un agitatore magnetico per 30 minuti a temperatura ambiente, permettendo ai batteri di raggiungere la media prima di essere consegnato in piastre a 384 pozzetti. 3. Inoculazione e incubazione delle piastre da 384 pozzetti contenentipiccole molecole Nota: La sterilità e le buone tecniche asettiche sono di primaria importanza per le seguenti operazioni. Per preparare il controllo positivo (100% di inibizione), aggiungere 20 ml tobramicina solfato (25 mg / ml) a 10 ml (sufficienti per un massimo di 12 lastre) della sottocultura preparata nella fase 2.3 e mescolare delicatamente. Pipettare 40 ml di cultura del controllo positivo nei pozzetti A23 – P23 (Figura 2). Per preparare il controllo negativo (0% di inibizione), aggiungere 30 ml dimetilsolfossido (DMSO) a 10 ml (sufficienti per un massimo di 12 lastre) della sottocultura preparata nella fase 2.3 e mescolare delicatamente. Pipettare 40 ml di cultura del controllo negativo nei pozzetti A24 – P24 (Figura 2). Per ciascuna delle piastre stampate con le piccole molecole, inoculare un volume di 40 ml di colture overnight diluite (riportati nel passo 2.3) nei pozzetti A1 – P22 (Figura 2). Nota: Ciò può essere ottenuto utilizzando un gestore di liquido robot. A causa delle proprietà eterogenee di colture batteriche, è importante mantenere una agitazione continua e moderata per mantenere i batteri costantemente distribuiti nei media durante la distribuzione. Per fare questo, continuate a mescolare la cultura acclimatati dal punto 2.4 magneticamente durante l'erogazione. Sigillare le piastre con un sigillo copertura permeabile all'aria e incubare per 6 ore a 37 ° C. Nota: La tenuta permeabile all'aria è fondamentale per mantenere le condizioni immutabili attraverso tutti i 384 pozzi e per aggirare il potenziale di sviluppo dei gradienti di ossigeno attraverso la piastra. 4. misurazione della crescita (OD 600) e intracellulare c-di-GMP Livello (GFP) Circa 30 minuti prima misurazione spettrofotometrica, pre-riscaldare il lettore di piastre a 37 ° C per evitare la condensazione. Rimuovere delicatamente la guarnizione del coperchio permeabile all'aria prima di leggere. Misurare la densità ottica alla lunghezza d'onda di 600 nm con un ambiente di 10 lampi al bene eun tempo di assestamento di 0,2 sec. Prima di misurare la fluorescenza, fare un guadagno automatico e la regolazione focale sulla base di ben A24 (controllo negativo) e impostare il valore target di guadagno al 75% (Figura 2). Dal software di controllo lettore di piastre, cliccare sulla misurazione di inizio e cliccare su '' Focus e Regolazione guadagno IDS / Plate 'scheda'. Seleziona '' Messa a fuoco '' e '' canale A '' a destra sulla finestra. Seleziona '' di regolazione del guadagno '' e '' Selected bene '', e digitare '' 75 '' il '' valore obiettivo ''. Infine, scegliere bene A24 nel layout piatto prima di fare clic su '' avviare la regolazione ''. Una volta che la regolazione viene effettuata, cliccare su '' Avviare la misurazione ''. Misurare la fluorescenza del reporter di GFP ad un massimi di eccitazione / emissione di 485/520 nm con una cornice di 10 flash al bene e un settlitempo ng di 0,2 sec. Raccogliere i dati provenienti da tutte le piastre esaminati. Nota: letture dati vengono salvati automaticamente come predefinita dal software di controllo lettore di piastre. Visualizzazione delle letture facendo clic sull'icona "Mars" all'interno del software di controllo per aprire il pacchetto di analisi statistica. Recuperare dati da "doppio clic" sul numero di targa di interesse per accedere ai dati per l'analisi. Analisi 5. I dati Valutare l'uniformità e la riproducibilità del test utilizzando l'analisi robusta z ', che è la metriche più comuni di qualità segnalati per schermi high-throughput. Calcolare z robusta 'con la formula: Dove MAD (mediana Absolute deviazione) è una stima della deviazione standard, p è il controllo positivo (100% di inibizione) ed n è il controllo negativo (0% di inibizione) sia per OD 600 e GFP valori. Nota: Un saggio con un valore solido z '(calcolato sia per OD 600 e GFP dati grezzi) maggiore o uguale a 0,5 è considerato come un saggio eccellente. Calcolare% di inibizione della crescita mediante la formula: Dove Xi OD600 è il iterata valore di OD 600 di ciascun campione. % Di inibizione OD600> 0, inibitore della crescita; % Di inibizione OD600 <0, promotore della crescita. Valutare l'inibizione% del livello intracellulare di c-di-GMP utilizzando la formula (la variazione di unità di intensità di fluorescenza arbitraria vengono corretti per la variazione di densità cellulare): Dove Xi GFP è il valore GFP iterata di ciascun campione. Inibizione% GFP> 0, inibitore c-di-GMP; % &# 160; Inibizione GFP <0, c-di-GMP promotore. Impostare una soglia di rilevamento per zone a 3 MAD dalla mediana (mediana ± 3 MAD), calcolato dal campione colto-out di ogni piatto, ipotizzando una distribuzione normale di punti di dati. Nota: Tuttavia, un ± 50% di inibizione cut-off può essere selezionato per saggi dose-risposta più riproducibili e precisi, se necessario.