Einrichtung eines Setup-Hochdurchsatz-Screening für kleine Moleküle, die Modulate c-di-GMP-Signalisierung in<em> Pseudomonas aeruginosa</em

Hinweis: Die Verfahren zur Klonierung und Transformation des gereinigten c-di-GMP – Reporter – Plasmid werden an anderer Stelle 12 diskutiert. 1. Erzeugung von GFP Tagged c-di-GMP – Reporter P. aeruginosa – Stamm Beimpfen von 5 ml LB-Medium (LB) Medium mit einer einzelnen Kolonie von P. aeruginosa und unter Schütteln bei 200 UpM über Nacht bei 37 ° C inkubieren. Transfer 2 ml der Übernachtkultur in 200 ml frischem LB-Medium in einem 1-Liter-Kolben und Inkubation bei 37 ° C bei 200 Umdrehungen pro Minute unter Schütteln. Überwachen der optischen Dichte bei 600 nm (OD 600) alle 30 Minuten durch eine 1 ml Probe aus dem Kolben nehmen und untersuchen mit einem Spektralphotometer (wie zuvor 12 beschrieben). Wenn die OD 600 erreicht zwischen 0,3-0,5, stellen 40 ml der Kultur in ein 50 ml konisches Zentrifugenröhrchen. Pelletieren Sie die Zellen von bei 4 ° C bei 8000 rpm für 10 min zentrifugiert, der Überstand verworfen und re-die Zellen in 40 ml eiskaltem, steril, 300 mM Saccharose-Lösung. Pellet die Zellen ein zweites Mal durch Zentrifugieren als 1,5 in Schritt beschrieben und resuspendieren in 20 ml eiskaltem, steril, 300 mM Saccharose-Lösung. Pellet die Zellen ein letztes Mal durch Zentrifugieren als 1,5 in Schritt beschrieben und resuspendieren in 400 ul eiskaltem, steril, 300 mM Saccharose-Lösung. Anmerkung: Die Zelldichte an diesem Punkt sollte etwa 1 x 10 11 koloniebildenden Einheiten pro Milliliter (CFU / ml) sein. Kühlen Sie die Zellen auf Eis für 30 min, wonach sie für die Elektroporation bereit sind. 1 ul einer 0,2 ug / ul pCdrA :: gfp C Plasmid 12 – Lösung zu 40 & mgr; l P. aeruginosa elektrokompetenten Zellen oben in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen vorbereitet , die auf Eis vorgekühlt wurde. Mischen Sie die Suspension und Transfer in ein vorgekühltes, 2 mm Elektrodenabstand, Elektroporationsküvette. Hinweis: pCdrA :: gfp </em> C: pUCP22Not-P cdra -RBSII- gfp (Mut3) -T 0 -T 1, Amp r Gm r, die ein fluoreszierendes Auslesen der intrazellulären Ebene von c-di-GMP in P. gibt aeruginosa – Stämmen wurde entwickelt und validiert von Rybtke et al. 12. Entfernen Sie die Feuchtigkeit auf der Außenseite der Küvette mit Seidenpapier und legen Sie die Küvette in die Probenkammer des -Elektroporator. Impuls mit einer Spannung von 2,5 kV, die Kapazität von 25 uF und Widerstand von 200 Ω. Entfernen Sie die Küvette und 1 ml LB-Medium. Dann übertragen die Zellen in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Inkubieren für 2 Stunden bei 37 ° C mit Schütteln bei 200 Upm. Verbreiten 10 ul, 50 ul und 100 ul-Aliquots der Kultur auf sterilem LB-Agarplatten mit Ampicillin ergänzt (bei einer Konzentration von 100 ug / ml) und Inkubieren der Platten bei 37 ° C über Nacht. Bestätigen Sie die GFP-Expression (excitatiauf bei 485 nm, Emission bei 520 nm) von der Platte unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem Standard-GFP-Kanal zu prüfen und eine einzige Kolonie holen zu impfen 5 ml LB. Inkubieren über Nacht, wie in Schritt 1.1 beschrieben. Mischen Sie 0,5 ml der Übernachtkultur mit 0,5 ml 50% Glycerin in einem 2 ml mit Schraubverschluss Rohr und bei -80 ° C. 2. Herstellung der Starterkultur zur Beimpfung Zwei Tage vor dem Bildschirm, die Platte , die P. aeruginosa – Stamm (mit dem pCdrA :: gfp C – Plasmid) aus dem -80 ° C Lager auf eine LB-Agar – Platte (mit Ampicillin in einer Konzentration von 100 ug / ml ergänzt) , indem Sie vorsichtig die Bakterien über die Platte Ausbreiten einer sterilen Inokulation mit Schleife. Die Platte über Nacht bei 37 ° C. Am Abend vor der Vorführung eine einzige Kolonie von P. impfen aeruginosa von der Platte in 10 ml LB – Medium in einem tu (mit Ampicillin in einer Konzentration von 100 ug / ml ergänzt)und die Vorkultur über Nacht bei 37 ° C unter Schütteln bei 200 rpm inkubiert. Am Tag des Bildschirms vorbereiten, eine Subkultur aus der Nacht Vorkultur von zunächst mit frischem LB – Medium bis zu einer OD 600 von 1,0 verdünnt und dann weiter mit 5% LB bis zu einer OD 600 von 0,04 (Verhältnis von 1:25) Verdünnen . Hinweis: Das Gesamtvolumen des inokulierten Mediums auf der Anzahl von Platten hängt getestet werden. 5% LB wird durch Verdünnen von 100% LB mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf die gewünschte Konzentration hergestellt. Wichtig ist , ermöglicht es dem Medium (5% LB) konstitutive Aktivierung von pCdrA :: gfp C in P. aeruginosa. Fügen eine sterile Magnetrührstab in den Behälter und rühre die Kultur bei minimaler Geschwindigkeit auf einem Magnetrührer für 30 min bei Raumtemperatur, so dass die Bakterien an die Medien zu akklimatisieren, bevor sie in 384-well Platten ausgegeben werden. 3. Inokulation und Inkubation der 384-Well-Platten, dieKleine Moleküle Hinweis: Die Sterilität und gute aseptischer Techniken in den folgenden Schritten an erster Stelle stehen. Um die positive Kontrolle (100% ige Hemmung) vorzubereiten, fügen Sie 20 ul Tobramycinsulfat (25 mg / ml) auf 10 ml (ausreichend für bis zu 12 Platten) der Subkultur hergestellt in Schritt 2.3 und vorsichtig mischen. Pipette 40 ul der positiven Kontrollkultur in die Vertiefungen A23 – P23 (Abbildung 2). Um die negative Kontrolle (0% Hemmung) vorzubereiten, fügen Sie 30 ul Dimethylsulfoxid (DMSO) bis 10 ml (ausreichend für bis zu 12 Platten) der Subkultur hergestellt in Schritt 2.3 und vorsichtig mischen. Pipette 40 ul der Negativkontrollkultur in Vertiefungen A24 – P24 (Abbildung 2). P22 (Figur 2) – für jede der Platten mit den kleinen Molekülen ausgestanzt, mit einem Volumen von 40 & mgr; l der verdünnten Übernachtkulturen (beschrieben in Schritt 2.3) in die Vertiefungen A1 inokulieren. Hinweis: Diese erreicht werden kann, einen Flüssigkeitshandler rob mitot. Aufgrund der heterogenen Eigenschaften von Bakterienkulturen, ist es wichtig, eine kontinuierliche und mßigem Rühren aufrechtzuerhalten Bakterien konsistent verteilt in den Medien zu halten, während Abgabe. Um dies zu tun, halten Sie die akklimatisiert Kultur aus Schritt Rühren 2,4 magnetisch bei der Abgabe. Verschließen Sie die Platten mit einer luftdurchlässigen Deckeldichtung und Inkubation für 6 Stunden bei 37 ° C. Hinweis: Die luftdurchlässige Dichtung ist entscheidend unveränderliche Bedingungen in allen 384 Vertiefungen zu erhalten und die mögliche Entwicklung von Sauerstoff-Gradienten über die Platte zu umgehen. 4. Messung des Wachstums (OD 600) und intrazellulärer c-di-GMP – Ebene (GFP) Etwa 30 Minuten vor dem spektrophotometrische Messung, vorwärmen den Plattenleser auf 37 ° C Kondensation zu vermeiden. die luftdurchlässige Abdeckung Dichtung vorsichtig entfernen, bevor das Lesen. Messung der optischen Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm mit einer Einstellung von 10 Blitzen pro Vertiefung undeine Einschwingzeit von 0,2 sec. Vor der Messung der Fluoreszenz, machen eine automatische Verstärkungs und Fokuseinstellung basiert auf gut A24 (Negativkontrolle) und den Verstärkungszielwert bei 75% (Abbildung 2) eingestellt. Von der Leser Steuerungssoftware Platte, klicken Sie auf Start Messung und klicken Sie auf '' Focus und Gain-Einstellung / Platte-IDs '' Registerkarte. Auswählen '' Fokuseinstellung '' und '' Kanal A '' auf der rechten Seite auf dem Fenster. Auswählen '' Gain-Einstellung '' und '' Selected gut '', und geben Sie in '' 75 '' als '' Zielwert ''. Schließlich wählen gut A24 in der Plattenlayout vor dem Klick auf, 'die Anpassung starten'. Sobald die Einstellung durchgeführt wird, klicken Sie auf '' Messung starten '. Messen der Fluoreszenz des GFP-Reporter bei einer Anregungs- / Emissionsmaxima von 485/520 nm mit einer Einstellung von 10 Blitzen pro Vertiefung und einem settling Zeit von 0,2 sec. Sammeln von Daten von allen untersuchten Platten. Hinweis: Die Datenwerte werden automatisch als Standard durch die Plattenleser Steuersoftware gespeichert. Ansicht Lesungen auf dem "Mars" Symbol in der Steuerungssoftware Klicken auf die statistische Analyse-Paket zu öffnen. Abrufen von Daten durch "Doppelklick" auf der Platte Anzahl von Interesse, die Daten für die Analyse zuzugreifen. 5. Datenanalyse Bewerten Sie die Gleichmäßigkeit und Reproduzierbarkeit des Tests robust z 'Analyse, die die am häufigsten verwendeten Qualitätsmetriken für High-Throughput-Screens gemeldet ist. Berechnen robust z 'mit der Formel: Wobei MAD (Median Abweichungsabsolut) eine Schätzung der Standardabweichung ist, p ist die positive Kontrolle (100% Hemmung) , und n ist die negative Kontrolle (0% Hemmung) sowohl OD 600 und GFP verte. Hinweis: Ein Assay mit einem robusten z 'Wert (berechnet für sowohl OD 600 und GFP Rohdaten) größer oder gleich 0,5 als ausgezeichneter Test angesehen wird. Berechnen% Hemmung des Wachstums unter Verwendung der Formel: Wo Xi OD600 ist die iterierte OD 600 – Wert jedes gut Probe. % Inhibition OD600> 0, Wachstumsinhibitor; % Hemmung OD600 <0, Wachstumsförderer. Beurteilen Sie die% Hemmung der intrazellulären Ebene von c-di-GMP unter Verwendung der Formel (die Änderung in willkürlichen Fluoreszenzintensität Einheiten sind für die Änderung der Zelldichte korrigiert): Wo Xi GFP ist der iterativen GFP Wert jeder Vertiefung Probe. % Inhibition GFP> 0, c-di-GMP – Inhibitor; % &# 160; Inhibition GFP <0, c-di-GMP – Promotor. Stellen Sie einen Schwellenwert für die Kollisionserkennung bei 3 MAD vom Median (Median ± 3 MAD), aus der Probe berechnet und Auslesen jeder Platte, eine normale Verteilung von Datenpunkten übernehmen. Hinweis: jedoch eine ± 50% ige Hemmung abgeschnittene kann für mehr reproduzierbare und genaue Dosis-Wirkungs-Assays ausgewählt werden, wenn erforderlich.