Mise en place d'un programme d'installation à haut débit pour le criblage de petites molécules qui modulent c-di-GMP Signalisation dans<em> Pseudomonas aeruginosa</em

Remarque: Les procédures de clonage et de transformation du c-di-GMP reporter plasmide purifié sont discutés ailleurs 12. 1. Génération de la GFP Tagged c-di-GMP Reporter P. aeruginosa Strain Inoculer 5 ml de bouillon de lysogénie (LB) avec une seule colonie de P. aeruginosa et incuber une nuit à 37 ° C sous agitation à 200 tours par minute. Transfert 2 ml de la culture d'une nuit dans 200 ml de milieu LB frais dans une fiole de 1 L et on incube à 37 ° C sous agitation à 200 tours par minute. Surveiller la densité optique à 600 nm (DO 600) toutes les 30 minutes en prélevant un échantillon de 1 ml dans le ballon et on examine à l' aide d' un spectrophotomètre (comme décrit précédemment 12). Lorsque la DO600 atteigne entre de 0,3 à 0,5, placer 40 ml de la culture dans un tube à centrifuger conique de 50 ml. Sédimenter les cellules par centrifugation à 8000 tpm pendant 10 min à 4 ° C, jeter le surnageant et re les cellules en suspension dans 40 ml d'une solution de saccharose 300 mM refroidi à la glace, stérile. Sédimenter les cellules une deuxième fois par centrifugation comme décrit dans l'étape 1.5 et remettre en suspension dans 20 ml de solution de saccharose 300 mM refroidi à la glace, stérile. Sédimenter les cellules une dernière fois par centrifugation comme décrit dans l'étape 1.5 et remettre en suspension dans 400 ul de solution 300 mM de saccharose glacé, stérile. Note: La densité cellulaire à ce point devrait être d' environ 1 x 10 11 unités formant colonie par millilitre (UFC / ml). Refroidir les cellules sur la glace pendant 30 min, après quoi ils sont prêts pour l'électroporation. Ajouter 1 ul d'un / ul plasmidique 12 solution à 0,2 pg pCdrA :: gfp C à 40 pi de P. des cellules électro-compétentes aeruginosa préparée ci – dessus dans un tube de 1,5 ml qui a été pré-refroidi sur de la glace. Mélanger la suspension et transférer dans un pré-réfrigéré, écartement des électrodes de 2 mm, cuvette d'électroporation. Note: pCdrA :: gfp </em> C: pUCP22Not-P CDRA -RBSII- gfp (Mut3) -T 0 -T 1, AmpR Gm r, ce qui donne une lecture de fluorescence du taux intracellulaire de c-di-GMP dans P. souches aeruginosa, a été développé et validé par Rybtke et al. 12. Éliminer l'humidité à l'extérieur de la cuve avec du papier absorbant et placer la cuvette dans la chambre de l'électroporateur de l'échantillon. Impulsions avec une tension de 2,5 kV, 25 uF de capacité et de résistance de 200 Ω. Retirer la cuvette et ajouter 1 ml de milieu LB. Ensuite, transférer les cellules à un tube de 1,5 ml microcentrifugeuse stérile et incuber pendant 2 heures à 37 ° C sous agitation à 200 tours par minute. Se propager 10 ul, 50 ul et 100 ul de parties aliquotes de la culture sur des plaques d'agar-LB stérile additionné d'ampicilline (à une concentration de 100 pg / ml), et on incube les plaques à 37 ° C pendant une nuit. Confirmer l'expression de la GFP (excitatisur à 485 nm, émission à 520 nm) en examinant la plaque sous un microscope à fluorescence avec un canal de GFP standard et choisir une colonie unique pour inoculer 5 ml LB. Incuber une nuit comme décrit dans l'étape 1.1. Mélanger 0,5 ml de la culture d'une nuit avec 0,5 ml de 50% de glycérol dans un 2 ml vis tube supérieur et conserver à -80 ° C. 2. Préparation de la culture de départ pour inoculer Deux jours avant l'écran, la plaque P. souche aeruginosa (contenant le pCdrA :: gfp C plasmidique) à partir de -80 ° C pâte sur une plaque LB-agar (additionné d'ampicilline à une concentration de 100 pg / ml) en écartant doucement les bactéries sur la plaque à l' aide d' une inoculation stérile boucle. Incuber la plaque pendant une nuit à 37 ° C. Le soir avant la projection, inoculer une seule colonie de P. aeruginosa à partir de la plaque dans 10 ml de milieu LB (supplémenté avec de l' ampicilline à une concentration de 100 pg / ml) dans un tuêtre et incuber la nuit pré-culture à 37 ° C sous agitation à 200 tours par minute. Le jour de l'écran, préparer une sous – culture de la pré-culture d'une nuit en diluant d'abord avec du milieu LB frais à une DO600 de 1,0, puis en diluant avec en outre 5% LB à une DO600 de 0,04 (rapport 01:25) . Remarque: Le volume total du milieu inoculé est fonction du nombre de plaques à tester. 5% LB est faite en diluant à 100% LB avec du tampon phosphate salin (PBS) à la concentration requise. Fait important, les médias (5% LB) permet une activation constitutive de pCdrA :: gfp C dans P. aeruginosa. Ajouter un barreau magnétique stérile dans le récipient et agiter la culture à la vitesse minimale sur un agitateur magnétique pendant 30 min à température ambiante, ce qui permet aux bactéries de s'acclimater aux médias avant qu'ils ne soient distribués dans des plaques à 384 puits. 3. Inoculation et incubation des plaques à 384 puits contenantLes petites molécules Note: Stérilité et de bonnes techniques d'asepsie sont primordiales pour les étapes suivantes. Pour préparer le contrôle positif (100% d'inhibition), ajouter 20 pl tobramycine sulfate (25 mg / ml) à 10 ml (suffisant pour un maximum de 12 plaques) de la sous-culture préparé à l'étape 2.3 et mélanger doucement. Pipette 40 ul de la culture de contrôle positif dans les puits A23 – P23 (Figure 2). Pour préparer le contrôle négatif (0% d'inhibition), ajouter 30 ul de diméthylsulfoxyde (DMSO) à 10 ml (suffisant pour un maximum de 12 plaques) de la sous-culture préparé à l'étape 2.3 et mélanger doucement. Pipette 40 ul de la culture de contrôle négatif dans les puits A24 – P24 (Figure 2). Pour chacune des plaques embouties avec les petites molécules, inoculer un volume de 40 pi des cultures d'une nuit dilué (décrites à l' étape 2.3) dans les puits A1 – P22 (Figure 2). Note: Ceci peut être réalisé en utilisant un manipulateur de liquide robot. En raison des propriétés hétérogènes de cultures bactériennes, il est important de maintenir une agitation continue et modérée pour empêcher les bactéries systématiquement distribués dans les médias pendant la distribution. Pour ce faire, continuer à remuer la culture acclimatée à l'étape 2.4 magnétiquement pendant la distribution. Sceller les plaques avec un joint de couverture perméable à l'air et incuber pendant 6 heures à 37 ° C. Remarque: Le joint perméable à l'air est essentielle pour maintenir des conditions immuables dans tous les 384 puits et de contourner le potentiel de développement de gradients d'oxygène à travers la plaque. 4. Mesure de la croissance (DO 600) et intracellulaires c-di-GMP Level (GFP) Environ 30 minutes avant la mesure spectrophotométrique, préchauffer le lecteur de plaque à 37 ° C pour éviter la condensation. Retirez délicatement le joint du couvercle perméable à l'air avant de lire. Mesurer la densité optique à une longueur d'onde de 600 nm avec un réglage de 10 flashs par puits etun temps de décantation de 0,2 s. Avant de mesurer la fluorescence, faire un gain automatique et un réglage focal basé sur le bien A24 (contrôle négatif) et définir la valeur cible de gain à 75% (figure 2). A partir du logiciel de contrôle de lecteur de plaque, cliquez sur la mesure de départ et cliquez sur le '' Focus et Gain de réglage ID / Plate onglet '. Sélectionnez '' Mise au point '' et '' Canal A '' sur la droite de la fenêtre. Sélectionnez '' Réglage du gain '' et '' bien sélectionné '', et tapez '' 75 '' comme '' Valeur cible ''. Enfin, choisissez bien A24 dans la disposition de la plaque avant de cliquer sur '' Lancer ajustement ''. Une fois le réglage effectué, cliquez sur '' Lancer la mesure ''. Mesurer la fluorescence du rapporteur GFP à un maximum d'excitation / émission de 485/520 nm avec un réglage de 10 flashs par puits et un settlitemps ng de 0,2 sec. Recueillir des données de toutes les plaques examinées. Remarque: les lectures de données sont automatiquement enregistrées par défaut par le logiciel plaque de commande de lecteur. Voir les lectures en cliquant sur l'icône "Mars" dans le logiciel de commande pour ouvrir le logiciel d'analyse statistique. Récupérer des données par "double clic" sur le numéro de la plaque d'intérêt pour accéder aux données pour l'analyse. Analyse 5. Données Évaluer l'uniformité et la reproductibilité du test en utilisant z robuste 'analyse, ce qui est des mesures de qualité les plus fréquemment rapportés pour les écrans à haut débit. Calculer z robuste »selon la formule suivante: Où MAD (Median Absolute Deviation) est une estimation de l' écart type, p est le contrôle positif (100% d'inhibition) et n est le contrôle négatif (0% d' inhibition) pour les 600 OD et GFP valeurs. Note: Un essai avec une «valeur de z robuste (calculé pour les 600 OD et GFP données brutes) supérieure ou égale à 0,5 est considéré comme un excellent test. Calculer le% d'inhibition de la croissance en utilisant la formule: Où Xi DO600 est la itérative DO 600 valeur de chaque échantillon. % D' inhibition DO600> 0, un inhibiteur de la croissance; % Inhibition DO600 <0, promoteur de croissance. Évaluer l'inhibition% du taux intracellulaire de c-di-GMP en utilisant la formule (le changement dans les unités d'intensité de fluorescence arbitraires sont corrigées pour la variation de la densité cellulaire): Où Xi GFP est la valeur de la GFP itérative de chaque puits d' échantillon. % Inhibition GFP> 0, inhibiteur de c-di-GMP; % &# 160; Inhibition GFP <0, promoteur c-di-GMP. Définir un seuil de détection de succès à 3 MAD de la médiane (médiane ± 3 MAD), calculée à partir de l'échantillon bien lu-outs de chaque plaque, en supposant une distribution normale des points de données. Note: Cependant, ± 50% d'inhibition de coupure peut être sélectionné pour les essais de réponse à la dose plus reproductibles et précis, si nécessaire.