Dit artikel beschrijft de high-throughput assay die met succes heeft bewezen grote bibliotheken van kleine moleculen te screenen op hun potentiële vermogen om cellulaire niveaus van cyclisch di-GMP manipuleren Pseudomonas aeruginosa, die een nieuw krachtig hulpmiddel voor antibacteriële geneesmiddelen en beproeving in.
Bacteriële resistentie tegen traditionele antibiotica heeft onderzoek pogingen om nieuwe drug targets te identificeren in recent ontdekte regelgeving trajecten gereden. Regulerende systemen die intracellulaire cyclisch di-GMP (c-di-GMP) te gebruiken als een tweede boodschapper zijn een dergelijke klasse van het doel. c-di-GMP is een signaalmolecuul gevonden in bijna alle bacteriën die werkt aan een uitgebreid scala van processen te reguleren, waaronder resistentie tegen antibiotica, de vorming van biofilm en virulentie. Begrijpen hoe c-di-GMP signalering controles aspecten van antibiotica resistente biofilm ontwikkeling benaderingen voorgesteld waarbij verandering van de cellulaire concentraties van de nucleotide of verstoring van deze signaalroutes kunnen een verminderde biofilmvorming of verhoogde gevoeligheid van de biofilms antibiotica. We beschrijven een eenvoudige high-throughput bioreporter protocol op basis van groen fluorescerend eiwit (GFP), waarvan de expressie onder de controle van de c-di-GMP reagerende promotor CDRA, Snel screenen op kleine moleculen met het vermogen om c-di-GMP cellulair niveau in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) moduleren. Dit eenvoudige protocol kan ruim 3500 verbindingen screenen binnen 48 uur en het vermogen aan te passen aan verschillende micro- organismen.
De snelle ontwikkeling van bacteriële resistentie tegen klinisch belangrijke antibiotica is een van de grootste problemen op dit moment geconfronteerd gezondheidswerkers wereldwijd. Dit falen van de traditionele antibiotica heeft nieuwe zoekopdrachten gereden voor de chemische stof die kunnen interfereren met bacteriële processen die betrokken zijn bij virulentie en progressie van de ziekte 1. Eén zo'n regelgevend systeem dat gebruik maakt van de intracellulaire tweede boodschapper cyclisch di-GMP (c-di-GMP) heeft onlangs een doel met veelbelovende geldigheid 2-4 is geworden. Vastgesteld is dat deze wereldwijde tweede messenger signaalmolecuul reguleert vele functies, waaronder antibiotica-resistentie, adhesie, biofilmvorming en de ziekte van 2-4.
Het is nu duidelijk dat het cellulaire niveau van c-di-GMP in de bacteriële cel wordt gecontroleerd door synthese en degradatie waarbij twee moleculen GTP gebruikt om c-di-GMP synthetiseren door GGDEF-domein bevattende diguanylate cyclases (DGCs) whereas c-di-GMP afbraak wordt gekatalyseerd door fosfodiesterasen (PDE), die ofwel een EAL of een HD-GYP domein (beoordeeld in (3, 5)). Eiwitten die deze domeinen bevatten vaak andere signalerende domeinen, suggereert dat de activiteit omzet c-di-GMP direct of indirect wordt geregeld door signalen milieu- of cellulaire 3,5. Bijgevolg c-di-GMP signaleringsfuncties voor de detectie van diverse omgevingsfactoren koppelen aan wijzigingen in bacteriële fenotype. c-di-GMP oefent zijn regulerend effect op bacteriën op het niveau van transcriptie, post-transcriptie en post- translatie door verschillende mechanismen 4.
Een grote invloed van c-di-GMP in veel bacteriecellen in de bepaling van bacteriële lifestyle en vooral bij de bestrijding van overgangen tussen beweeglijke plankton cellen sessiele cellen gehecht aan oppervlakken of georganiseerd in de meercellige structuur van biofilms 3,5. In het algemeen, hoge cellulaireniveaus van c-di-GMP geassocieerd met de vorming en sessility biofilm, terwijl lage niveaus cellulaire motiliteit bevorderen en virulentie factor synthese in veel bacteriële pathogenen 3,5. Zo zou een meer gedetailleerde kennis van de werking van c-di-GMP signalering strategieën veroorloven voor de remming van de vorming van biofilm en de virulentie in bacteriële ziekteverwekkers. Dit is een moeilijke taak gezien het feit dat de meeste bacteriële genomen coderen talrijke eiwitten met GGDEF, EAL en / of HD-GYP domeinen (bijvoorbeeld P. aeruginosa heeft meer dan 40 eiwitten) en meerdere effectoren 6,7.
Echter, zelfs met deze complexiteit, suggereert recent bewijs dat strategieën manipuleren c-di-GMP signalering kan worden ontwikkeld om zowel voorkomen antibiotische resistente infecties ontwikkelen of ze vatbaar voor het immuunsysteem of een efficiënte verwerking door gelijktijdige toediening van klassieke antibiotica 2. In lijn met deze, is experimenteel aangetoond dat kunstmatige dalingvan intracellulaire c-di-GMP in in vitro -grown P. aeruginosa leidt tot verminderde biofilmvorming en verhoogde gevoeligheid voor antimicrobiële stoffen, terwijl P. -developed aeruginosa biofilms op siliconenimplantaten in de peritoneale holte van muizen, kan worden gedispergeerd op een soortgelijke wijze 8-11.
Hier beschrijven we een high-throughput, fluorescentie gebaseerde reportertest kleine moleculen die overwogen cellulaire c-di-GMP niveaus moduleren P. screenen aeruginosa (Figuur 1). De test is gebaseerd op het meten van c-di-GMP cellulair niveau door een eerder ontwikkeld GFP reporter, waarvan de expressie wordt transcriptioneel gekoppeld aan de c-di-GMP-responsieve promotor Cdra 12. Dit protocol beschrijft de methode voor expressie van het construct in de P. aeruginosa stam plaats, samengestelde plaat bereiding, cultuur enting in 384 putjes, groeiomstandigheden, zoals well als details met betrekking tot het verzamelen, beheren en analyseren (figuur 1). In het algemeen zal dit protocol onderzoekers helpen om potentieel te identificeren nieuwe verbindingen gericht c-di-GMP signalisatie in bacterie, en voor gebruik in het onderzoek gericht op het begrijpen van de biologie van P. aeruginosa.
Om de behandeling van bacteriële infecties te verbeteren, is het duidelijk dat een beter begrip van bacteriële gedrag op moleculair regelgevingsniveau vereist. De hier beschreven werkwijze zal komen voor microbiologen, biochemici en artsen die willen kleine moleculen die de potentie te manipuleren of het cellulaire concentraties van c-di-GMP in bacteriën ontdekken zijn. De werkwijze maakt gebruik van een recent ontwikkelde GFP bioreporter cellulaire niveaus van c-di-GMP in P. bewaken aeruginosa 12. Deze bioreporter is gevalideerd en belangrijker niet de groei van de gebruikte stam indien gekweekt in LB 5% in PBS beïnvloeden. Het gebruik van een hele-cel-scherm om kleine moleculen te identificeren die c-di-GMP niveau verandert in vivo overwint de grote problemen van doelgerichte geneesmiddelen qua molecule penetratie door de bacteriële membranen, met name door die van Gram-negatieve bacteriën . Belangrijk, tHij test blijkt zeer robuust als een robuuste z 'waarde consistent boven 0,5 werd waargenomen in alle schermen tot nu toe. Screening met dit protocol een aantal kleine moleculen die remmen en / of intracellulaire c-di-GMP niveaus in P. bevorderen onthullen aeruginosa. Bovendien is deze test ook het potentieel om bactericide of bacteriostatische verbindingen resulteert in een daling van de OD 600 uitlezing identificeren.
Hoewel niet in het gedeelte protocol besproken, zijn er een aantal belangrijke overwegingen voor de voorbereiding van het experiment. Het is essentieel om in gedachten te houden dat de GFP bioreporter is gebaseerd op een plasmide. Hoewel het reporterplasmide bekend zeer stabiel te zijn P. aeruginosa kan verloren gaan voortdurend na-plating, vandaar de noodzaak om vers uitgeplaat stammen gebruiken in een -80 ° C glycerol voorraad en controle fluorescentie expressie kritisch. Het is ook zeer waardevol voor uniforme groei te handhaven gedurende het schermaangezien eventuele schommelingen in deze voorwaarden domino-effect op het scherm zou kunnen hebben. Dit omvat het maken van bepaalde dat media en antibiotica premade in batch en gebruikt in de loop van het scherm. Bacterieculturen niet groeien (gebaseerd op de OD 600 read-outs) op een uniforme wijze is een veel voorkomend probleem voor de meeste high-throughput screens van deze aard. Dit kan te wijten zijn aan effecten of afgeven van een niet homogeen bacteriekweek in de platen rand. Voor de eerste, zorg ervoor dat een gas-doorlatende afsluiting wordt gebruikt tijdens de incubatie is van vitaal belang. Terwijl de laatstgenoemde, de priming vloeistofhandler buis met een volume van de kweek ten minste drie maal het dode volume van de buis zelf wordt aanbevolen. Het is cruciaal om de magnetische roerder bij minimumsnelheid tijdens het afgeven houden. Tijdens het monitoren en opslag van de 384-putjesplaten voor consistente groei in de loop van de experimenten voorop, een situatie te vermijden is het stapelen van platen tijdens incubatie als het un veroorzakengezocht zuurstofgradiënten waardoor een scheef in het groeipatroon. Het is ook belangrijk dat de DMSO als vehikel gebruikt als negatieve controle geen negatieve invloed op groei van de stam van belang. Veel van deze problemen geassocieerd met groei kan worden voorkomen door het uitvoeren van een mock scherm met de bacteriestam plaats voorafgaand aan screening. Interpretatie van gegevens verdient ook aandacht besteed dat c-di-GMP remming resultaten worden berekend door de verandering in willekeurige fluorescentie-intensiteit eenheden die moeten worden gecorrigeerd voor de verandering in de cel dichtheid. Daartoe verschillende wiskundige formules beoordelen de gegevensuitvoer uit deze dienen ook te worden overwogen. Bijvoorbeeld kan een verbinding weergegeven als een C-di-GMP inhibitor maar eigenlijk remmend of vice versa, waarbij voorzichtige interpretatie van geïdentificeerde hits.
Er zijn verschillende nadelen en beperkingen die in de gang van dit moet worden beschouwdhigh-throughput-cel-gebaseerde scherm. Bijvoorbeeld, de bio-reporter functies op een indirecte maat van cellulaire c-di-GMP niveaus met behulp van een fluorescente probe waarvan de detectie eigenschappen verloren zou kunnen gaan door kleine moleculen die in een scherm. Een tangentiële probleem is dat de celgebaseerde assay geeft geen informatie over het mechanisme achter veranderingen in de niveaus van intracellulaire c-di-GMP. Daarom moeten belangrijke observaties uit experimenten worden bevestigd met een high-performance vloeistofchromatografie-massaspectrometrie benadering, die wordt beschouwd als de "gouden standaard" methode voor het meten van intracellulaire c-di-GMP fluctuaties in bacteriën. Bovendien kan onze procedure alleen informatie over het gedrag van bacteriën gekweekt in vitro bacteriële cellen die in het kader van de gastheer (in vivo) hun activiteiten snel te wijzigen door deze omgeving. Bovendien is het verbruik van een GFP bioreporter verstaan het scherm geen rekeninghoudend met de fysiologische toestand van de bacteriecellen. Echter, kan het protocol worden aangepast aan microscopisch onderzoek van afzonderlijke putjes in de loop van het scherm.
Zelfs met deze overwegingen en beperkingen Dit high-throughput assay is nog een robuuste scherm kleine moleculen die interfereren met de intracellulaire c-di-GMP niveaus. Aangezien vele microbiële species waaronder veel bacteriële pathogenen werden bestudeerd om de modulatie van intracellulaire c-di-GMP niveaus kenmerkend zouden ons protocol worden toegepast op diverse bacteriesoorten en uitgebreid tot de studie van complexere multispecies bacteriën modellen. De test kan eenvoudig worden geoptimaliseerd voor andere bacteriële species door het veranderen van de kweekomstandigheden gebruikt of kan worden aangepast aan andere uitgangen lezen met verschillende bioreporters. Verschillende incubatietijden kunnen worden toegepast, afhankelijk van de groeifase van belang. Wanneer echter opschalen of toenemende doorvoercapaciteit, is importan t in gedachten dat de bacteriën nog zal groeien tijdens de plaat voorbereidingen en uitlezen metingen te houden. Daarom wordt aanbevolen maximaal 15 platen screenen tegelijk met dit protocol. Bovendien gebruiken platen met meer dan 384 putjes wellicht niet toelaat uniforme groei, die verdere optimalisatie. Bij afbouw van het aantal platen, kan het beter zijn om handmatig te enten met behulp van een elektronische pipet in plaats van een liquid handling robot. Het is duidelijk dat het protocol kan worden gebruikt om kleine moleculen die biofilms dispergeren onderzoeken, aangezien anti-biofilm verbindingen interfereren met c-di-GMP signalering. Het protocol kan worden gesaneerd verschillende aspecten van bacteriële fysiologie begrijpen. Aangezien c-di-GMP signalering voorkomt in de meeste bacteriën, door het bestuderen van de fysiologie van deze organismen met dit protocol kunnen we verschillende chemische stimuli bepalen om te bepalen of hun werkingsmechanisme vereist c-di-GMP signalering.
_content "> Samenvattend, de robuustheid en veelzijdigheid van de benadering die in dit protocol zal de identificatie van chemische modulatoren van c-di-GMP signalering bij vele biologische systemen bevorderen.The authors have nothing to disclose.
We thank the Tolker-Nielsen lab for their generous donation of reporter constructs used to develop the screen. We also thank members of the Ryan laboratory for their helpful comments and critical reading of the manuscript. The work of the authors has been supported in part by grants awarded by the Wellcome Trust (WT100204AIA senior fellowship grant to R.P.R. and 093714/Z/10/Z PhD scholarship to K.N.R.).
Lysogeny Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022-1KG |
Sucrose | Sigma Aldrich | S0389-1KG |
Lysogeny Broth with Agar (Lennox) | Sigma Aldrich | L2897-1KG |
Ampicillin sodium | Sigma Aldrich | A0166-25G |
Glycerol | Sigma Aldrich | G5516-1L |
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Life technologies | 10010-056 |
Tobramycin sulfate | Sigma Aldrich | T1783-100MG |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 276855-250ML |
Genesys 10S UV-Vis spectrophotometer | Thermoscientific | 840-208100 |
2 mm gap electroporator cuvette | Bio-Rad | 1652092 |
BioRad GenePulser XCell electroporator | Bio-Rad | 1652662 |
Leica Fluorescent Stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ16FA |
BRAND magnetic stirring bar, PTFE, cylindrical with pivot ring (sterilise by autoclaving before use) | Sigma Aldrich | Z328952-10EA |
384-well, white-walled, clear-bottom plates | Greiner | 781098 |
Multidrop Combi reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 |
Multidrop Combi tubing | Thermo Scientific | 24073290 |
VIAFLO II 16-channel electronic pipette | Integra Biosciences | 4642 |
100 mL sterile disposable reagent reservoirs | Fisher Scientific | 12399175 |
AeraSeal air-permeable membranes | Sigma Aldrich | MKBQ1886 |
Pherastar plate reader (Software version: 4.00 R4, Firmware version: 1.13) | BMG Labtech | Pherastar FS |