Generación de células madre pluripotentes inducidas por el Uso de sinoviocitos similares a fibroblastos aislados de las articulaciones de pacientes con artritis reumatoide
Summary
Aquí se describe un protocolo para la generación de células madre pluripotentes humanas inducida de sinoviocitos similares a fibroblastos derivados del paciente, utilizando un sistema lentiviral sin células alimentadoras.
Abstract
células somáticas maduras pueden revertirse a un estado de células madre pluripotentes-como el uso de un conjunto definido de factores de reprogramación. Numerosos estudios han generado células pluripotentes inducidas-madre (iPSCs) de diversos tipos de células somáticas mediante la transducción cuatro factores de transcripción Yamanaka: Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc. El estudio de las células iPS se mantiene a la vanguardia de la investigación biológica y clínica. En particular, iPSCs específicos del paciente se pueden utilizar como una herramienta para el estudio pionero de patobiología de la enfermedad, ya que iPSCs pueden ser inducidos a partir del tejido de cualquier individuo. La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria crónica, clasificados por la destrucción del cartílago y la estructura ósea en la articulación. hiperplasia sinovial es una de las principales razones o síntomas que conducen a estos resultados en la AR. Los sinoviocitos tipo fibroblasto (FLSs) son las principales células componentes de la membrana sinovial hiperplásica. FLSs en la articulación ilimitadamente proliferan, finalmente invadir el cartil adyacentesla edad y el hueso. Actualmente, la membrana sinovial hiperplásica se puede quitar solamente por un procedimiento quirúrgico. La membrana sinovial eliminado se utiliza para la investigación RA como un material que refleja la condición inflamatoria de la articulación. Como un jugador importante en la patogénesis de la AR, FLSs se puede utilizar como un material para generar e investigar las iPSCs de pacientes con AR. En este estudio, hemos utilizado la FLSs de un paciente con AR para generar células iPS. El uso de un sistema lentiviral, descubrimos que puede generar FLSs RA-paciente específico IPSC. Las iPSCs generados a partir de FLSs se pueden utilizar además como una herramienta para estudiar la fisiopatología de la AR en el futuro.
Introduction
Las células madre pluripotentes son la plataforma de próxima generación en diversos campos clínicos y biológicos. Son una herramienta prometedora que puede utilizarse en el modelado de la enfermedad, la detección de drogas, y la terapia médica regenerativa. Las células madre embrionarias humanas (hESCs) se utilizaron principalmente para estudiar y comprender células pluripotentes. Sin embargo, aislado por la destrucción del blastocisto humano, hESCs están asociados con varias preocupaciones éticas. En 2007, el Dr. Shinya Yamanaka y su equipo invirtieron el proceso de programación celular y desarrollan células madre a partir de células somáticas adultas humana 1,2. Por lo tanto, a diferencia de hESCs, inducida por las células madre pluripotentes (iPSCs) se pueden generar a partir de células somáticas maduras, evitando los obstáculos éticos.
Por lo general, iPSCs son generados por la entrega de cuatro genes exógenos: Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc. Estos factores Yamanaka son entregados originalmente usando sistemas de lentivirus y retrovirus. Las primeras células iPS se derivaron de ratón c somáticaells 3. Posteriormente, la técnica se aplicó a los fibroblastos dérmicos humanos 1,2. Estudios posteriores generado correctamente iPSCs de diversas fuentes, tales como orina 4, la sangre 5,6, queratinocitos 7, y varios otros tipos de células. Sin embargo, hay algunas células somáticas que no han sido usados en la reprogramación, y el cribado de las capacidades de reprogramación de diversos tipos de células de tejidos específicos en el estado de la enfermedad, sigue siendo necesaria.
La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad que puede afectar a todas las juntas y conducir a enfermedades autoinmunes en otros órganos. La AR afecta a alrededor del 1% de los adultos en el mundo desarrollado. Es una enfermedad bastante común y su incidencia aumenta cada año 8. Sin embargo, RA es difícil de identificar en las primeras etapas y oncebone destrucción ocurre no existe un tratamiento que puede recuperar el daño. Por otra parte, la eficacia del fármaco varía de paciente a paciente, y es difícil predecir el médicoine que se requiere. Por lo tanto, se necesita el desarrollo de un método de selección de fármacos, y se requiere un material celular que puede reflejar las condiciones de la AR.
Los sinoviocitos similares a fibroblastos (FLSs) son un participante celular activo en la patogénesis de la AR 9,10. FLSs existe en el revestimiento de la íntima sinovial entre la cápsula y cavidad de la junta, que también se refiere como la membrana sinovial. Mediante el apoyo a la estructura de la articulación y el aporte de nutrientes al cartílago circundante, FLSs suelen jugar un papel crucial en la función de las articulaciones y el mantenimiento. Sin embargo, FLSs en la AR tiene un fenotipo invasivo. RA FLSs tienen un fenotipo similar al cáncer, finalmente destruir el hueso circundante por la proliferación infinita 10. Con esta característica única, FLSs se puede utilizar como un material prometedor que puede reflejar la patobiología de la AR. Sin embargo, estas células son rara vez se producen, y los fenotipos celulares alteran medida que las células pasan por varios pasajes de in vitro </em> condiciones. Por lo tanto, puede ser complicado de usar RA FLSs como una herramienta que puede representar el estado del paciente.
En teoría, RA células iPS derivadas de pacientes (RA-iPSCs) pueden convertirse en una herramienta ideal para la detección de drogas y una mayor investigación. IPSCs generadas tienen la capacidad de auto-renovación y se pueden mantener y expandir in vitro. Con la pluripotencia, estas células pueden diferenciarse en condrocitos y osteocitos linajes maduros, que pueden contribuir material celular para la investigación específica en la AR y otras enfermedades relacionadas con los huesos 11.
En este estudio, se demuestra cómo aislar y expandir FLSs de una membrana sinovial extraído quirúrgicamente, y cómo generar RA-iPSCs de FLSs utilizando lentivirus que contenían factores Yamanaka.
Protocol
Representative Results
Discussion
Antes del descubrimiento de iPSCs, los científicos utilizan principalmente los CES para estudiar la biología de células madre y otros linajes celulares a través de la diferenciación. Sin embargo, los CES originan a partir de la masa interna de un blastocisto, que es un embrión en etapa temprana. Para aislar los CES, la destrucción del blastocisto es inevitable, plantea cuestiones éticas que son imposibles de superar. Por otra parte, aunque los CES tienen características stemness y pluripotencia, no pueden ser o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Research Program funded by the Korea Centers for Disease Control and Prevention (HI13D2188).
Materials
| 100mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| FLS Isolation Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forcep | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| Collagenase | Sigma Aldrich | C6885-100MG | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | 54956 | |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| iPSC Generation Materials | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Lentivirus | |||
| DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | iPSC media ingredient (500 mL) |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/mL) |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | iPSC media ingredient (Conc.: 14 ng/mL) |
| Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/mL) |
| Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | iPSC media ingredient (Conc.: 100 ng/mL) |
| Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/mL) |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/mL) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | iPSC media ingredient (Conc.: 64 μg/mL) |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Guality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 |
References
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Scott, D. L., Wolfe, F., Huizinga, T. W. Rheumatoid arthritis. Lancet. 376 (9746), 1094-1108 (2010).
- Chang, S. K., Gu, Z., Brenner, M. B. Fibroblast-like synoviocytes in inflammatory arthritis pathology: the emerging role of cadherin-11. Immunol Rev. 233 (1), 256-266 (2010).
- Bartok, B., Firestein, G. S. Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis. Immunol Rev. 233 (1), 233-255 (2010).
- Lee, J., et al. Generation of disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 16 (1), R41 (2014).
