Summary

Romatoid Artrit Hastalarının Mafsallar İzole fibroblast benzeri sinoviyosit kullanma Kaynaklı-pluripotent Kök Hücre Üretimi

Published: October 16, 2016
doi:

Summary

Burada besleyici hücreler olmadan lentiviral sistemi kullanılarak, hastaya türetilmiş fibroblast benzeri sinoviyositler insan kaynaklı-pluripotent kök hücrelerin üretilmesi için bir protokol açıklar.

Abstract

Olgun somatik hücre yeniden programlama faktörleri tanımlanmış bir dizi kullanarak pluripotent kök hücre benzeri duruma ters çevrilebilir. Oct4, Sox2, Klf4 ve c-Myc: Çeşitli çalışmalar, dört Yamanaka transkripsiyon faktörlerini transducing çeşitli somatik hücre tiplerinden kaynaklı-pluripotent kök hücreleri (iPSCs) yarattı. iPSCs çalışma, biyolojik ve klinik araştırmaların kesme kenarında kalır. iPSCs herhangi bir bireyin dokusundan indüklenebilir yana Özellikle, hastaya özel iPSCs, hastalık patobiyolojisi çalışma için öncü bir araç olarak kullanılabilir. Romatoid artrit (RA) eklem kıkırdak ve kemik yapısının bozulmasına sınıflandırılan kronik bir enflamatuar hastalığıdır. Sinovyal hiperplazi RA'da bu sonuçlara yol önemli nedenlerinden veya belirtilerden biridir. Fibroblast benzeri sinoviyositler (FLSs) hiperplastik sinovyumda ana bileşeni hücrelerdir. eklemde FLSs limitlessly sonunda komşu cartil işgal prolifereyaş ve kemik. Şu anda, hiperplastik sinovyum, sadece cerrahi bir prosedür ile çıkarılabilir. Kaldırılan sinovya ortak inflamatuar durumunu yansıtan bir malzeme olarak RA araştırma için kullanılmıştır. RA patogenezinde önemli bir oyuncu olarak, FLSs oluşturmak ve RA hastalarının iPSCs araştırmak için bir malzeme olarak kullanılabilir. Bu çalışmada, iPSCs oluşturmak için bir RA hastanın FLSs kullanılır. lentiviral sistemi kullanarak, FLSs RA hastaya özgü IPSC oluşturabilir keşfetti. FLSs oluşturulan iPSCs gelecekte daha da RA patofizyolojisinin incelemek için bir araç olarak kullanılabilir.

Introduction

Pluripotent kök hücreler çeşitli klinik ve biyolojik alanlarda yeni nesil platform vardır. Bu hastalığın modelleme, ilaç tarama, ve rejeneratif tıbbi tedavide kullanılabilir gelecek vaat eden bir araçtır. İnsan Embriyonik Kök Hücreler (hESC) esas çalışma ve pluripotent hücreler anlamak için kullanıldı. Bununla birlikte, insan blastosist imha ile izole edilmiş, HESC çok etik kaygılar ile ilişkilidir. 2007 yılında, Dr. Shinya Yamanaka ve ekibi hücre programlama sürecini tersine insan yetişkin somatik hücre 1,2 kök hücre geliştirdi. Bu nedenle, HESC farklı olarak, indüklenen-kök hücreleri (iPSCs) etik engel kaçınarak olgun somatik hücrelerinden üretilebilir.

Oct4, Sox2 Klf4 ve c-Myc: Genellikle, iPSCs dört ekzojen genlerin verilmesi ile elde edilir. Bunlar Yamanaka faktörleri aslında lentiviral ve retroviral sistemler kullanılarak teslim edilir. İlk iPSCs fare somatik C elde edilmiştirarşın 3. Daha sonra, bu teknik, insan dermal fibroblastlarında 1,2 uygulanmıştır. Daha sonraki çalışmalar başarıyla idrar 4 kan 5,6 gibi çeşitli kaynaklardan iPSCs üretilen 7 keratinositler, ve çeşitli diğer hücre türleri. Bununla birlikte, bazı somatik yeniden programlama kullanılan edilmemiş hücreler ve hastalık durumunda özel dokularda çeşitli hücre tiplerinin yeniden programlama yetenekleri tarama vardır hala gereklidir.

Romatoid artrit (RA), tüm eklemleri grev ve diğer organlarda otoimmün koşullara yol açabilecek bir hastalıktır. RA gelişmiş dünyada erişkinlerin yaklaşık% 1'ini etkiler. Bu oldukça yaygın bir hastalıktır ve görülme sıklığı her yıl 8 artar. Ancak, RA erken evrelerde tespit etmek zordur ve yıkım oncebone zarar kurtarabilirsiniz hiçbir tedavi yoktur oluşur. Ayrıca, ilacın yararını hastadan hastaya farklılık gösterir ve Medic tahmin etmek zorgereklidir ine. Bu nedenle, bir ilaç-tarama yönteminin geliştirilmesi gereklidir ve RA şartlarını yansıtacak bir hücre malzeme gereklidir.

Fibroblast benzeri sinoviyosit (FLSs) RA 9,10 patogenezinde aktif bir hücresel katılımcı vardır. FLSs de sinovyumdaki olarak adlandırılır eklem kapsülü ve oyuk arasındaki eklem iç yüzeyi bulunmaktadır. eklem yapısını destekleyen ve çevreleyen kıkırdak besinleri sağlayarak, FLSs genellikle eklem fonksiyon ve bakım önemli bir rol oynamaktadır. Ancak, RA'da FLSs invaziv bir fenotip var. RA FLSs sonunda sonsuz çoğalması 10 çevreleyen kemik yok, bir kanser gibi fenotip vardır. Bu eşsiz özelliği ile FLSs RA patobiyolojisi yansıtabilir umut verici bir madde olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, bu hücreler nadiren üretilir, ve hücreler, in vitro çok geçitler geçmesi gibi hücre fenotipleri değiştirebilir </em> durumlar. Nedenle, hastanın durumunu temsil edebilecek bir araç olarak RA FLSs kullanmak için karmaşık olabilir.

Teorik olarak, RA hasta kaynaklı iPSCs (RA-iPSCs) ilaç tarama ve ileri araştırmalar için ideal bir araç haline gelebilir. Oluşturulan iPSCs kendini yenileme yeteneğine sahip ve tutulan ve in vitro genişletilebilir. Pluripotensin, bu hücreler, RA ve diğer kemik ile ilgili hastalıklar 11 özel araştırma için hücre materyalini katkıda olgun kondrosit ve osteosit soy, ayırt edilebilir.

Bu çalışmada, biz izole etmek ve Yamanaka faktörleri içeren lentiviruses kullanarak FLSs RA-iPSCs oluşturmak için bir ameliyatla çıkarıldı sinovyum ve nasıl dan FLSs genişletmek için nasıl gösterilmektedir.

Protocol

Etik Beyanı: Bu çalışma protokolü Kore Katolik Üniversitesi (KC12TISI0861) kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmıştır. 1. Sinoviyosit İzolasyon ve Genişleme sinoviyosit İzolasyon cerrahi makas iki çift ve forseps bir çift sterilize edin. 100 mm çanak sinoviyal doku transferi ve% 1 penisilin / streptomisin içeren fosfat tamponlu tuz, 5 ml (PBS) ile yıkanır. sarımsı yağ dokusu ve kemik kalıntılarını kesti. Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortam?…

Representative Results

Bu çalışmada, bir lentiviral sistemi kullanılarak FLSs gelen iPSCs oluşturmak için bir protokol açıklar. Şekil 1A FLS izolasyon protokolü basit bir şemasını gösterir. sinovyanın cerrahi olarak çıkarılması ardından, doku cerrahi makas kullanarak küçük parçalar halinde doğranmış edildi. Kollajenaz doku kümeleri hücreleri izole etmek için ilave edildi. Hücreler, daha sonraki işlemlerden önce 14 gün boyunca inkübe edilmiştir. Şeki…

Discussion

iPSCs keşfinden önce, bilim adamları başta farklılaşma ile kök hücre biyolojisi ve diğer hücre soyları incelemek için EKH kullanılır. Ancak, EKH bir erken evre embriyo bir blastosist, iç kitle kaynaklanır. EKH izole etmek için, blastosist tahrip üstesinden gelinemez etik sorunlar yükselterek, kaçınılmazdır. EKH stemness özellikleri ve pluripotensini olsa Ayrıca, bu bireylerden elde edilemez ve bazen de kişisel analizleri ve hastalık taranması için ideal bir araç bulunmaktadır.

<p class…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Research Program funded by the Korea Centers for Disease Control and Prevention (HI13D2188).

Materials

100mm Dish TPP 93100
6-well Plate TPP 92006
50 mL Cornical Tube SPL 50050
15 mL Cornical Tube SPL 50015
10 mL Disposable Pipette Falcon 7551
5 mL Disposable Pipette Falcon 7543
12-well Plate TPP 92012
FLS Isolation Materials
Surgical Scissors
Surgical Forcep
DPBS Life Technologies 14190-144
DMEM Life Technologies 11995-073
Penicilin Streptomycin Sigma Aldrich P4333
Fetal Bovine Serum Life Technologies 16000-044
Collagenase Sigma Aldrich C6885-100MG
Parafilm Sigma Aldrich 54956
PBS/1 mM EDTA Life Technologies 12604-039
iPSC Generation Materials
DMEM Life Technologies 11885
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Life Technologies 11140-050
β-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M3148
Polybrene Chemicon TR-1003-G
Penicilin Streptomycin Life Technologies P4333
Fetal Bovine Serum Life Technologies 16000-044
DPBS Life Technologies 14190-144
Lentivirus
DMEM/F12, HEPES Life Technologies 11330-057 iPSC media ingredient (500 mL)
Sodium Bicarbonate Life Technologies 25080-094 iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/mL)
Sodium Selenite Sigma Aldrich S5261 iPSC media ingredient  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin Sigma Aldrich T3705 iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/mL)
Basic FGF2 Peprotech 100-18B iPSC media ingredient  (Conc.: 100 ng/mL)
Human Insulin Life Technologies 12585-014 iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/mL)
Human TGFβ1 Peprotech 100-21 iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/mL)
Ascorbic Acid Sigma Aldrich A8960 iPSC media ingredient  (Conc.: 64 μg/mL)
Polybrene Chemicon TR-1003
Sodium Butyrate Sigma Aldrich B5887
Vitronectin Life Technologies A14700
ROCK Inhibitor Sigma Aldrich Y0503
Guality Control Materials
18 mm Cover Glass Superior HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde Tech & Innovation BPP-9004
Triton X-100 BIOSESANG 9002-93-1
Bovine Serum Albumin Vector Lab SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody Millipore MAB4304
Anti-Oct4 Antibody Santa Cruz SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody Millipore MAB4360
Anti-Sox2 Antibody Biolegend 630801
Anti-TRA-1-81 Antibody Millipore MAB4381
Anti-Klf4 Antibody Abcam ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody Molecular Probe A11037
DAPI Molecular Probe D1306
Prolong gold antifade reagent Invitrogen P36934
Slide Glass, Coated Hyun Il Lab-Mate HMA-S9914
Trizol Invitrogen 15596-018
Chloroform Sigma Aldrich 366919
Isoprypylalcohol Millipore 109634
Ethanol Duksan 64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit Thermo Scientfic K1622
i-Taq DNA Polymerase iNtRON BIOTECH 25021
UltraPure 10X TBE Buffer Life Technologies 15581-044
loading star Dyne Bio A750
Agarose Sigma-Aldrich 9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker Enzynomics DM003
Alkaline Phosphatase Millipore SCR004

References

  1. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  4. Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
  5. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  6. Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
  7. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  8. Scott, D. L., Wolfe, F., Huizinga, T. W. Rheumatoid arthritis. Lancet. 376 (9746), 1094-1108 (2010).
  9. Chang, S. K., Gu, Z., Brenner, M. B. Fibroblast-like synoviocytes in inflammatory arthritis pathology: the emerging role of cadherin-11. Immunol Rev. 233 (1), 256-266 (2010).
  10. Bartok, B., Firestein, G. S. Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis. Immunol Rev. 233 (1), 233-255 (2010).
  11. Lee, J., et al. Generation of disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 16 (1), R41 (2014).

Play Video

Cite This Article
Rim, Y. A., Park, N., Nam, Y., Ju, J. H. Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients. J. Vis. Exp. (116), e54072, doi:10.3791/54072 (2016).

View Video