הדור של גזע תאים מושרה-פלוריפוטנטיים שימוש פיברובלסטים דמויי Synoviocytes מבודדת מן מפרידים של בחולי דלקת מפרקים שגרונית
Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקול להפקת תאי גזע פלוריפוטנטיים נגרם אדם מן synoviocytes חולה נגזרת כמו-פיברובלסטים, באמצעות מערכת lentiviral ללא תאים מזינים.
Abstract
תאי סומטיים בוגרים יכולים להיות הפוכים לתוך גזע פלוריפוטנטיים דמוי תא מדינה באמצעות סט של גורמי תכנות מחדש מוגדר. מחקרים רבים יצרו תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) סוגי תאים שונים סומטיים ידי transducing ארבעה גורמי שעתוק יאמאנאקה: Oct4, Sox2, Klf4 ו- c-Myc. המחקר של iPSCs נשאר בחוד החנית של מחקר ביולוגי וקליני. בפרט, iPSCs המטופל ספציפי יכול לשמש ככלי חלוצים למחקרי של pathobiology מחלה, מאז iPSCs יכול להיגרם מן הרקמה של כל אדם. דלקת מפרקים שגרונית (RA) היא מחלה דלקתית כרונית, אשר סווגו על ידי הרס הסחוס ומבנה העצם במפרק. היפרפלזיה הסינוביאלי הוא אחד הסיבות העיקריות או סימפטומים שיובילו לתוצאות אלה ב- RA. Synoviocytes פיברובלסטים דמויי (FLSs) הם התאים המרכיבים העיקריים הסינוביום hyperplastic. FLSs במפרק להתרבות ללא הגבלה, בסופו של דבר פולש cartil סמוךגיל ועצמות. נכון לעכשיו, synovium hyperplastic ניתן להסיר רק על ידי הליך כירורגי. הסינוביום שהוסר משמש למחקר RA כחומר המשקף את המצב הדלקתי של המפרק. כשחקן מרכזי בפתוגנזה של RA, FLSs יכול לשמש כחומר ליצור ולחקור את iPSCs של חולי RA. במחקר זה, השתמשנו FLSs של חולה RA כדי ליצור iPSCs. באמצעות מערכת lentiviral, גילינו כי FLSs יכול ליצור iPSC המטופל הספציפי RA. IPSCs המופק FLSs ניתן להשתמש כדי להמשיך ככלי ללמוד בפתופיזיולוגיה של RA בעתיד.
Introduction
תאי גזע פלוריפוטנטיים הם הפלטפורמה של הדור הבא בתחומים קליניים וביולוגיים שונים. הם כולים מבטיחים כי ניתן להשתמש ב דוגמנות מחלה, הקרנת סמים, וטיפול רפואי רגנרטיבית. אדם תאי גזע עוברי (hESCs) שמשו בעיקר כדי ללמוד ולהבין תאים פלוריפוטנטיים. עם זאת, מבודד על ידי הרס של הבלסטוציסט האנושי, hESCs המשויכים מספר שיקולים אתיים. בשנת 2007, ד"ר שיניה יאמאנאקה וצוות הפכו את תהליך תכנות תא ופתחו תאי גזע תאי סומטיים אדם בוגרי 1,2. לכן, בניגוד hESCs, נגרמת pluripotent בתאי גזע (iPSCs) ניתן להפיק מן התאים הסומטיים בוגרים, הימנעות המכשולים המוסריים.
בדרך כלל, iPSCs מופקים על ידי משלוח של ארבעה גנים אקסוגניים: Oct4, Sox2, Klf4, ו- c-Myc. גורמי יאמאנאקה אלה מועברים במקור באמצעות מערכות lentiviral ו retroviral. IPSCs הראשון נגזרו ג סומטיים העכבראמות 3. לאחר מכן, הטכניקה יושמה כדי fibroblasts עורי האנושי 1,2. מחקרים מאוחרים יותר שנוצרו iPSCs בהצלחה ממקורות שונים, כגון שנתן 4, דם 5,6, קרטינוציטים 7, סוגי תאים כמה אחרים. עם זאת, ישנם כמה תאים סומטיים שלא היה בשימוש תכנות מחדש, והקרנת יכולות תכנות מחדש של תאים מסוגים שונים ברקמות ספציפיות במצב מחלה, עדיין נדרש.
דלקת מפרקים שגרונית (RA) היא מחלה שיכולה לפגוע בכל המפרקים להוביל מחלות אוטואימוניות באיברים אחרים. RA המשפיעה על כ -1% מהמבוגרים בעולם המפותח. זוהי מחלה די נפוצה שכיחותה גדלה מידי שנת 8. עם זאת, דלקת מפרקים שגרונית היא קשה לזהות בשלבים מוקדמים oncebone הרס מתרחשת אין טיפול שיכול לשחזר את הנזק. יתר על כן, יעילות תרופה שונה מחולה לחולה, וזה קשה לחזות את החובשine כי נדרש. לכן, הפיתוח של שיטת סמי הקרנה יש צורך, ואת חומר תא זה יכול לשקף את התנאים של RA נדרש.
Synoviocytes פיברובלסטים דמויים (FLSs) מהווה השתתף הסלולר פעיל בפתוגנזה של 9,10 RA. FLSs להתקיים רירית intimal הסינוביאלי בין קופסית מפרק ואת החלל, אשר גם הוא המכונה הסינוביום. על ידי תמיכה במבנה המשותף ומתן מזיני הסחוס שמסביב, FLSs בדרך כלל לשחק תפקיד מכריע בתפקוד ותחזוקה משותפים. עם זאת, FLSs ב- RA יש פנוטיפ פולשני. יש RA FLSs פנוטיפ סרטן דמוי, בסופו של דבר להרוס את העצם שמסביב ב -10 התפשטות אינסופית. עם מאפיין ייחודי זה, יכול לשמש FLSs כחומר מבטיח שיכול לשקף את pathobiology של RA. עם זאת, תאים אלו הם לעתים נדירות מיוצרים, ואת פנוטיפים התא לשנות כמו התאים לעבור כמה קטעים במבחנה </em> תנאים. לכן, זה יכול להיות מסובך להשתמש RA FLSs ככלי שיכול לייצג את מצבו של החולה.
באופן תיאורטי, iPSCs החולה נגזר RA (RA-iPSCs) יכול להיות כלי אידיאלי עבור הקרנת סמים ומחקר נוסף. יצר iPSCs יכולת התחדשות עצמית והוא יכול להישמר והרחיב במבחנה. עם pluripotency, תאים אלה יכולים להיות מובחנים לתוך שושלות הכונדרוציטים ו osteocyte בוגרות, אשר יכול לתרום חומר תא של מחקרים ספציפיים ב- RA ומחלות הקשורות עצם אחרים 11.
במחקר זה, אנו מדגימים כיצד לבודד להרחיב FLSs מתוך synovium הוסר בניתוח, וכיצד ליצור RA-iPSCs מ FLSs באמצעות lentiviruses המכיל גורמים יאמאנאקה.
Protocol
Representative Results
Discussion
לפני גילוי iPSCs, מדענים משמשים בעיקר ESCs ללמוד ביולוגית גזע תא שושלות תאים אחרות באמצעות בידול. עם זאת, ESCs מקורן המסה הפנימית של הבלסטוציסט, המהווה העובר בשלב מוקדם. כדי לבודד ESCs, הרס של הבלסטוציסט הוא בלתי נמנע, העלאת סוגיות אתיות כי ניתן להתגבר. יתר על כן, למרות שיש ESCs מא…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Research Program funded by the Korea Centers for Disease Control and Prevention (HI13D2188).
Materials
| 100mm Dish | TPP | 93100 | |
| 6-well Plate | TPP | 92006 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| 12-well Plate | TPP | 92012 | |
| FLS Isolation Materials | |||
| Surgical Scissors | |||
| Surgical Forcep | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| Collagenase | Sigma Aldrich | C6885-100MG | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | 54956 | |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| iPSC Generation Materials | |||
| DMEM | Life Technologies | 11885 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003-G | |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| Lentivirus | |||
| DMEM/F12, HEPES | Life Technologies | 11330-057 | iPSC media ingredient (500 mL) |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080-094 | iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/mL) |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | iPSC media ingredient (Conc.: 14 ng/mL) |
| Human Transfferin | Sigma Aldrich | T3705 | iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/mL) |
| Basic FGF2 | Peprotech | 100-18B | iPSC media ingredient (Conc.: 100 ng/mL) |
| Human Insulin | Life Technologies | 12585-014 | iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/mL) |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/mL) |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A8960 | iPSC media ingredient (Conc.: 64 μg/mL) |
| Polybrene | Chemicon | TR-1003 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Vitronectin | Life Technologies | A14700 | |
| ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Guality Control Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Triton X-100 | BIOSESANG | 9002-93-1 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-SSEA4 Antibody | Millipore | MAB4304 | |
| Anti-Oct4 Antibody | Santa Cruz | SC9081 | |
| Anti-TRA-1-60 Antibody | Millipore | MAB4360 | |
| Anti-Sox2 Antibody | Biolegend | 630801 | |
| Anti-TRA-1-81 Antibody | Millipore | MAB4381 | |
| Anti-Klf4 Antibody | Abcam | ab151733 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11029 | |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody | Molecular Probe | A11037 | |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10X TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Alkaline Phosphatase | Millipore | SCR004 |
References
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Scott, D. L., Wolfe, F., Huizinga, T. W. Rheumatoid arthritis. Lancet. 376 (9746), 1094-1108 (2010).
- Chang, S. K., Gu, Z., Brenner, M. B. Fibroblast-like synoviocytes in inflammatory arthritis pathology: the emerging role of cadherin-11. Immunol Rev. 233 (1), 256-266 (2010).
- Bartok, B., Firestein, G. S. Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis. Immunol Rev. 233 (1), 233-255 (2010).
- Lee, J., et al. Generation of disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 16 (1), R41 (2014).
