Summary

Микроинъекция для Трансгенез и редактирования генома в трехиглой колюшками

Published: May 13, 2016
doi:

Summary

Трансгенные манипуляции и редактирования генома имеют решающее значение для функционально тестирования роли генов и цис – -regulatory элементов. Здесь подробный протокол микроинъекции для генерации геномных модификаций (в том числе Tol2-опосредованных флуоресцентных репортерных трансгенов конструкций, Таленс и CRISPRs) представлен для эмерджентное модели рыб, в трехиглой колюшки.

Abstract

Трёхиглая колюшка рыбы возникла как мощной системы для изучения генетической основы широкого спектра морфологических, физиологических и поведенческих фенотипов. Замечательные разнообразные фенотипы, которые развивались, как морские популяции адаптироваться к окружающей среде бесчисленных пресноводных, в сочетании со способностью пересекать морские и пресноводные формы, дают редкую позвоночное систему, в которой генетика может быть использована для сопоставления геномных областей управлени эволюционировали черты. Отличные геномные ресурсы теперь доступны, способствуя молекулярно-генетических рассечение эволюционировали изменений. В то время как эксперименты картографирования генерировать списки интересных генов-кандидатов, функциональные генетические манипуляции необходимы для проверки роли этих генов. регуляции генов могут быть изучены с трансгенными репортерных плазмид и БАС интегрированы в геном, используя систему транспозаза Tol2. Функции специфических генов – кандидатов и цис – -regulatory элементы могут быть оценены путем индукции целевыхмутации с Talen и CRISPR / cas9 редактирования генома реагентов. Все методы требуют введения нуклеиновых кислот в оплодотворенных эмбрионов колюшки одноклеточных, задача сделал сложной толстой хориона из колюшки эмбрионов и относительно небольшим и тонким бластомере. Здесь подробный протокол для микроинъекции нуклеиновых кислот в колюшки эмбрионов описано для трансгенных и редактирования генома приложений для изучения экспрессии генов и функции, а также методов оценки успешности трансгеноза и обнаружения стабильных линий.

Introduction

Одним из основных компонентов понимания того, как возникает биоразнообразие определения генетических и развития основ эволюционировали фенотипических изменений в природе. Трёхиглая колюшка рыбы, Gasterosteus колюшка, стала отличной моделью для изучения генетической основы эволюции. Колюшками претерпели множество адаптивных эволюционных изменений , как морские рыбы колонизировали бесчисленные среды пресной воды вокруг северного полушария, что приводит к драматическим морфологическими, физиологическими, и поведенческие изменения 1. Геномы лиц из двадцати одного населения колюшки были секвенированы и собраны, и карта связи с высокой плотностью была сформирована для дальнейшего совершенствования сборки 2,3. Генетические эксперименты картирования выявили участки генома , лежащие в основе эволюционировали фенотипов 4 6, а в некоторых случаях функциональные роли специфических генов – кандидатов были протестированы 7,8, Ряд геномных областей , лежащих в основе морфологических изменений были идентифицированы с многообещающими генов – кандидатов, однако эти кандидаты еще не были функционально протестированы 9 12. Кроме того, колюшки являются общими моделями для изучения генетики популяций / геномики 13,14, видообразования 15, поведение 1, эндокринологии 16, экотоксикологии 17, иммунология 18 и паразитологии 19. Будущие исследования в каждой из этих областей выиграют от способности выполнять функциональные генетические манипуляции в колюшки. Помимо манипулирования их кодирующих последовательностей, роли генов – кандидатов , могут быть оценены путем изучения их цис – -regulatory последовательности и функционально увеличение, уменьшение или устранение экспрессии гена – кандидата. Микроинъекция и Трансгенез методы в колюшками хорошо установлены 7,8,20 и первоначально были разработаны с использованием meganuclease-опосредованнойСпособ 21 впервые описан в оризии 22. Модифицированный метод микроинъекции, представленный здесь был оптимизирован для обоих Tol2-опосредованной трансгеноза и недавно разработанный геном редактирования реагентов, включая Таленс и CRISPRs.

Изменения в цис -regulatory элементов , как полагают, иметь решающее значение для морфологической эволюции, как СНГ -regulatory изменения могут избежать негативных последствий плейотропных мутаций кодирующих 23. Таким образом, тестирование и сравнение предполагаемых цис – -regulatory последовательности стала главной целью все большего числа эволюционных исследований. Кроме того, большинство вариантов человеческих болезней являются регуляторными варианты 24,25 и системы модели позвоночных животных крайне необходимы для изучения цис -regulatory функции элемента и логики. Рыбы , которые оплодотворяют их эмбрионы внешне в большом количестве предлагают мощные системы позвоночных животных для изучения цис -regulation. Система транспозонов Tol2, в котором foreiдп ДНК должны быть интегрированы в геном примыкают Tol2 транспозаза сайты связывания и со-инъецируют Tol2 мРНК транспозазы, работает с высокой эффективностью для успешной интеграции плазмидной конструкции в геномах рыб 26 28. Как правило, потенциальный энхансер клонировали выше базального промотора (например, hsp70l 29) и ген флуоресцентного репортер , такой как EGFP (усиленный зеленый флуоресцентный белок) или mCherry в Tol2 позвоночнике и вводили транспозазы мРНК 26. Наблюдение экспрессии флуоресцентного репортера, либо в инъецированных эмбрионов или потомство с стабильно интегрированных трансгенов, предоставляет информацию о пространственно-временной регуляции экспрессии генов с приводом от предполагаемого энхансера. В дальнейших экспериментах, валидированные энхансеры могут быть использованы для управления тканеспецифичную избыточную экспрессию генов, представляющих интерес.

Для анализа больших цис -regulatory регионов, высокого качества большого вставки геномабиблиотеки IC помощью бактериальных искусственных хромосом (БАС) были построены для морских и пресноводных колюшки 30. Эти BACs можно recombineered заменить ген с флуоресцентным репортерным геном в контексте большой (150-200 кб) геномной области 31. Флуоресцентный репортер затем выражается в пространственно-временной схеме, что определяется регуляторными последовательностями внутри БАКа. Для исследований в рыбе, сайты Tol2 могут быть добавлены к БАК , чтобы облегчить геномную интеграцию 32,33. На более поздних стадиях развития , когда гибридизация является технически сложной задачей, флуоресцентное считывание BAC может быть использован для изучения закономерностей экспрессии генов, как было показано для колюшки костного морфогенетического белка 6 (BMP6) 20. Кроме того, флуоресцентные паттерны экспрессии в личности могут быть отслежены с течением времени, которое не может быть достигнуто с гибридизация. BACs также может быть использован для добавления additionaл копию геномной области, чтобы увеличить дозировку представляющего интерес гена.

Для изучения функции гена, редактирование генома является взрывным расширением поля , которое может быть использовано для получения целевых изменений геномных последовательностей в самых разнообразных организмов 34. Активатора транскрипции, как эффекторные нуклеазы (Таленс) являются модульными, последовательность конкретных нуклеазы первоначально выделенные из возбудителей болезней растений , которые могут быть точно сконструированных связываться непосредственно с геномной последовательностью выбора и генерировать двойной нити сломать 35,36. Кластерные регулярно interspaced короткие палиндромные повторы (CRISPR) / системы CAS первоначально были найдены в бактериях и использовать направляющую РНК и белка cas9 генерировать разрыв в последовательности ДНК – мишени , комплементарной направляющей 37. Последующее ремонт двойного разрыва цепи, созданной обоими Таленс и CRISPRs часто выходит за небольшой вставки или делеции, которые могут нарушить функции последовательности-мишени35-37. В колюшками, Таленс были использованы для срыва экспрессии гена путем ориентации энхансер 20, и оба Таленс и CRISPRs успешно производят мутации в кодирующих последовательностях (неопубликованные данные). Подробный протокол для генерации CRISPRs для использования в данио рерио могут быть использованы в качестве ориентира для разработки CRISPRs для колюшками 38.

Трансгенные и геномные эксперименты редактирования требуют введения нуклеиновых кислот в недавно оплодотворенного одноклеточного эмбриона. Путем введения трансгенов или геном-инструмент для редактирования на ранних стадиях развития, число генетически измененных дочерних клеток в эмбрионе максимальна. Введенный эмбрионы затем визуально обследованы на флуоресценцию или молекулярно-скрининг на модификации генома. Если клетки, способствующие зародышевой успешно целенаправленным, трансген или мутация может быть передана к подмножеству потомства, даже тогда, когда после инъекции летальность высока. Мозаичное рыба может быть ауткроссной илискрещивали и потомство их просеивают, чтобы восстановить мутантные аллели или стабильно интегрированный трансген интерес. Этот протокол описывает способы введения трансгенов и генома редактирования реагентов в эмбрионы колюшки одноклеточных и мониторинга для успешных геномных изменений.

Protocol

Вся рыба работа была одобрена Institutional Animal Care и использования комитета Калифорнийского университета в Беркли (номер протокола R330) путем. 1. Подготовьте нуклеиновые кислоты для инъекций Tol2 Плазмида Трансгенез (адаптировано из Fisher 26). Вырезать 10 мкг транспозаза плазми?…

Representative Results

Для гена трансгенов репортера , которые имеют энхансер активность, успешное инъекции приведет к конкретным, клеточной экспрессии трансгена (рис 4A, 4C). Введенные рыба может быть ауткроссной для получения стабильных линий ( на примере САК стабильной ли…

Discussion

Потребители инъекционных одноклеточных колюшки эмбрионов для трансгеноза или редактирования генома представляет три основные задачи. Во-первых, по отношению к данио эмбрионов, колюшка эмбриональных хориона является жестким и часто ломаются иглы. Эта проблема может быть частично пре…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была частично финансируется NIH R01 # DE021475 (CTM), в NIH Predoctoral Training Грант 5T32GM007127 (PAE), и НФС Graduate Fellowship (Research НАЗ). Мы благодарим Кевин Schwalbach для выполнения BAC recombineering и инъекции, Ник Donde для генерации данных секвенирования CRISPR Sanger, и Кэтрин Липари за полезную обратную связь по протоколу инъекции.

Materials

Stereomicroscope with transillumination Leica S6e/ KL300 LED
Manual micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33 Marzhauser M33 Micromanipulator
Pressure Injecion system Applied Scientific Instrumentation MPPI-3
Back pressure unit Applied Scientific Instrumentation BPU
Micropipette holder kit Applied Scientific Instrumentation MPIP
Magnetic base holder Applied Scientific Instrumentation Magnetic base
Foot switch Applied Scientific Instrumentation FSW
Iron plate (magnetic base) Narishige IP
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument P-97
Disposable transfer pipettes Fisher 13-711-7M
0.5% phenol red in DPBS Sigma  P0290 injection tracer
#5 forceps, biologie dumoxel  Fine Science Tools 11252-30 for needle breaking
Micropipette Storage Jar World Precision Instruments E210 holds needles
6", 6 teeth per inch plaster drywall saw Lenox 20571 (S636RP) hold eggs for injection
13 cm x 13 cm glass plate any hardware store
Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID  World Precision Instruments 1B100-F4 *harder glass than zebrafish injection capillaries
150 x 15mm petri dish Fisher FB0875714 raise stickleback embryos
35 x 10mm petri dish Fisher 08-757-100A store eggs pre-injection
Instant Ocean Salt Instant Ocean SS15-10
Sodium Bicarbonate Sigma S5761-500G
Tricaine methanesulfonate/MS-222 Western Chemical Inc MS222 fish anaesthesia/euthanasia
Sp6 transcription kit Ambion AM1340 For transcription of TALENs and transposase mRNA
RNeasy cleanup kit Qiagen 74104 purify transposase or TALEN RNA
QiaQuick PCR cleanup kit Qiagen 28104 clean up plasmids for injection
Proteinase K 20 mg/ml Ambion AM2546 for DNA preparation
Nucleobond BAC 100 kit Clontech 740579 for BAC DNA preparation
NotI NEB R0189L
Phusion polymerase Fisher F-530L
Qiagen PlasmidPlus Midi kit Qiagen 12943 contains endotoxin rinse buffer
QIAQuick Gel Extraction Qiagen 28704  for sequencing induced mutations
Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol Sigma P2069-100ML
Sodium acetate Sigma S2889-250G
Ethanol (molecular biology grade) Sigma E7023-500ML
Agarose Sigma A9539
50X Tris-acetate-EDTA buffer ThermoFisher B49
0.5-10KbRNA ladder ThermoFisher 15623-200
Nanodrop  Spectrophotometer Thermo Scientific Nanodrop 2000
Paraformaldehyde Sigma 158127-500G
10X PBS ThermoFisher 70011-044
1kb Plus DNA Ladder ThermoFisher 10787-018
Potassium Chloride Sigma P9541-500G
Magnesium Chloride Sigma M8266-100G
NP-40 ThermoFisher 28324
Tween 20 Sigma P1379-500ML
Tris pH 8.3 Teknova T1083
12-strip PCR tube Thermo Scientific AB-1113

References

  1. Bell, M. A., Foster, S. A. . The Evolutionary Biology of the Threespine Stickleback. , (1994).
  2. Jones, F. C., et al. The genomic basis of adaptive evolution in threespine sticklebacks. Nature. 484 (7392), 55-61 (2012).
  3. Glazer, A. M., Killingbeck, E. E., Mitros, T., Rokhsar, D. S., Miller, C. T. Genome assembly improvement and mapping convergently evolved skeletal traits in sticklebacks with Genotyping-by-Sequencing. G3. 5 (7), 1463-1472 (2015).
  4. Miller, C. T., et al. Modular skeletal evolution in sticklebacks is controlled by additive and clustered quantitative trait Loci. Genetics. 197 (1), 405-420 (2014).
  5. Shapiro, M. D., et al. Genetic and developmental basis of evolutionary pelvic reduction in threespine sticklebacks. Nature. 428 (6984), 717-723 (2004).
  6. Colosimo, P. F., et al. Widespread parallel evolution in sticklebacks by repeated fixation of Ectodysplasin alleles. Science. 307 (5717), 1928-1933 (2005).
  7. Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327 (5963), 302-305 (2010).
  8. O’Brown, N. M., Summers, B. R., Jones, F. C., Brady, S. D., Kingsley, D. M. A recurrent regulatory change underlying altered expression and Wnt response of the stickleback armor plates gene EDA. eLife. , e05290 (2015).
  9. Cleves, P. A., et al. Evolved tooth gain in sticklebacks is associated with a cis-regulatory allele of Bmp6. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (38), 13912-13917 (2014).
  10. Erickson, P. A., Glazer, A. M., Cleves, P. A., Smith, A. S., Miller, C. T. Two developmentally temporal quantitative trait loci underlie convergent evolution of increased branchial bone length in sticklebacks. Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 281 (1788), 20140822 (2014).
  11. Glazer, A. M., Cleves, P. A., Erickson, P. A., Lam, A. Y., Miller, C. T. Parallel developmental genetic features underlie stickleback gill raker evolution. EvoDevo. 5 (1), (2014).
  12. Ellis, N. A., et al. Distinct developmental and genetic mechanisms underlie convergently evolved tooth gain in sticklebacks. Development. 142, 2442-2451 (2015).
  13. Hohenlohe, P. A., Bassham, S., Currey, M., Cresko, W. A. Extensive linkage disequilibrium and parallel adaptive divergence across threespine stickleback genomes. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 367 (1587), 395-408 (2012).
  14. Hohenlohe, P. A., et al. Population genomics of parallel adaptation in threespine stickleback using sequenced RAD tags. PLoS Genet. 6 (2), e1000862 (2010).
  15. McKinnon, J. S., Rundle, H. D. Speciation in nature: the threespine stickleback model systems. Trends Ecol. Evol. 17 (10), 480-488 (2002).
  16. Shao, Y. T., et al. Androgen feedback effects on LH and FSH, and photoperiodic control of reproduction in male three-spined sticklebacks, Gasterosteus aculeatus. Gen. Comp. Endocrinol. 182, 16-23 (2013).
  17. Katsiadaki, I., et al. Three-spined stickleback: an emerging model in environmental endocrine disruption. Environ. Sci. Int. J. Environ. Physiol. Toxicol. 14 (5), 263-283 (2007).
  18. Lenz, T. L., Eizaguirre, C., Rotter, B., Kalbe, M., Milinski, M. Exploring local immunological adaptation of two stickleback ecotypes by experimental infection and transcriptome-wide digital gene expression analysis. Mol. Ecol. 22 (3), 774-786 (2013).
  19. Barber, I. Sticklebacks as model hosts in ecological and evolutionary parasitology. Trends Parasitol. 29 (11), 556-566 (2013).
  20. Erickson, P. A., et al. A 190 base pair, TGF-β responsive tooth and fin enhancer is required for stickleback Bmp6 expression. Dev. Biol. 401 (2), 310-323 (2015).
  21. Hosemann, K. E., Colosimo, P. F., Summers, B. R., Kingsley, D. M. A simple and efficient microinjection protocol for making transgenic sticklebacks. Behaviour. 141 (11/12), 1345-1355 (2004).
  22. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech. Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  23. Carroll, S. B. Evo-Devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution. Cell. 134 (1), 25-36 (2008).
  24. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
  25. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  26. Fisher, S., et al. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 1 (3), 1297-1305 (2006).
  27. Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11403-11408 (2000).
  28. Kikuta, H., Kawakami, K. Transient and stable transgenesis using Tol2 transposon vectors. Methods in Moleculario Biology: Zebrafish. , 69-84 (2009).
  29. Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Dev. Camb. Engl. 127 (9), 1953-1960 (2000).
  30. Kingsley, D. M., et al. New genomic tools for molecular studies of evolutionary change in threespine sticklebacks. Behaviour. 141 (11/12), 1331-1344 (2004).
  31. Mortlock, D. P., Guenther, C., Kingsley, D. M. A general approach for identifying distant regulatory elements applied to the Gdf6 gene. Genome Res. 13 (9), 2069-2081 (2003).
  32. Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).
  33. Suster, M. L., Sumiyama, K., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish and mice. BMC Genomics. 10 (1), 477 (2009).
  34. Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
  35. Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).
  36. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
  37. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  38. Talbot, J. C., Amacher, S. L. A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles. Zebrafish. 11 (6), 583-585 (2014).
  39. Kawakami, K., et al. A Transposon-Mediated Gene Trap Approach Identifies Developmentally Regulated Genes in Zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  40. Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning a laboratory manual. , (2012).
  41. Villefranc, J. A., Amigo, J., Lawson, N. D. Gateway compatible vectors for analysis of gene function in the zebrafish. Dev. Dyn. 236 (11), 3077-3087 (2007).
  42. Doyle, E. L., et al. TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction. Nucleic Acids Res. 40 (W1), W117-W122 (2012).
  43. Untergasser, A., et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), e115 (2012).
  44. Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio) . , (2007).
  45. Dale, R. M., Topczewski, J. Identification of an evolutionarily conserved regulatory element of the zebrafish col2a1a. Dev. Biol. 357 (2), 518-531 (2011).
  46. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  47. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of Gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).

Play Video

Cite This Article
Erickson, P. A., Ellis, N. A., Miller, C. T. Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks. J. Vis. Exp. (111), e54055, doi:10.3791/54055 (2016).

View Video