Микроинъекция для Трансгенез и редактирования генома в трехиглой колюшками

Одним из основных компонентов понимания того, как возникает биоразнообразие определения генетических и развития основ эволюционировали фенотипических изменений в природе. Трёхиглая колюшка рыбы, Gasterosteus колюшка, стала отличной моделью для изучения генетической основы эволюции. Колюшками претерпели множество адаптивных эволюционных изменений , как морские рыбы колонизировали бесчисленные среды пресной воды вокруг северного полушария, что приводит к драматическим морфологическими, физиологическими, и поведенческие изменения ^1. Геномы лиц из двадцати одного населения колюшки были секвенированы и собраны, и карта связи с высокой плотностью была сформирована для дальнейшего совершенствования сборки ^2,3. Генетические эксперименты картирования выявили участки генома , лежащие в основе эволюционировали фенотипов ^{4 – 6,} а в некоторых случаях функциональные роли специфических генов – кандидатов были протестированы ^7,8, Ряд геномных областей , лежащих в основе морфологических изменений были идентифицированы с многообещающими генов – кандидатов, однако эти кандидаты еще не были функционально протестированы ^{9 – 12.} Кроме того, колюшки являются общими моделями для изучения генетики популяций / геномики ^13,14, видообразования ^15, поведение ^1, эндокринологии ^16, экотоксикологии ^17, иммунология ¹⁸ и паразитологии ^19. Будущие исследования в каждой из этих областей выиграют от способности выполнять функциональные генетические манипуляции в колюшки. Помимо манипулирования их кодирующих последовательностей, роли генов – кандидатов , могут быть оценены путем изучения их цис – -regulatory последовательности и функционально увеличение, уменьшение или устранение экспрессии гена – кандидата. Микроинъекция и Трансгенез методы в колюшками хорошо установлены ^7,8,20 и первоначально были разработаны с использованием meganuclease-опосредованнойСпособ ²¹ впервые описан в оризии ^22. Модифицированный метод микроинъекции, представленный здесь был оптимизирован для обоих Tol2-опосредованной трансгеноза и недавно разработанный геном редактирования реагентов, включая Таленс и CRISPRs.

Изменения в цис -regulatory элементов , как полагают, иметь решающее значение для морфологической эволюции, как СНГ -regulatory изменения могут избежать негативных последствий плейотропных мутаций кодирующих ^23. Таким образом, тестирование и сравнение предполагаемых цис – -regulatory последовательности стала главной целью все большего числа эволюционных исследований. Кроме того, большинство вариантов человеческих болезней являются регуляторными варианты ^24,25 и системы модели позвоночных животных крайне необходимы для изучения цис -regulatory функции элемента и логики. Рыбы , которые оплодотворяют их эмбрионы внешне в большом количестве предлагают мощные системы позвоночных животных для изучения цис -regulation. Система транспозонов Tol2, в котором foreiдп ДНК должны быть интегрированы в геном примыкают Tol2 транспозаза сайты связывания и со-инъецируют Tol2 мРНК транспозазы, работает с высокой эффективностью для успешной интеграции плазмидной конструкции в геномах рыб ^{26 – 28.} Как правило, потенциальный энхансер клонировали выше базального промотора (например, hsp70l ²⁹⁾ и ген флуоресцентного репортер , такой как EGFP (усиленный зеленый флуоресцентный белок) или mCherry в Tol2 позвоночнике и вводили транспозазы мРНК ^26. Наблюдение экспрессии флуоресцентного репортера, либо в инъецированных эмбрионов или потомство с стабильно интегрированных трансгенов, предоставляет информацию о пространственно-временной регуляции экспрессии генов с приводом от предполагаемого энхансера. В дальнейших экспериментах, валидированные энхансеры могут быть использованы для управления тканеспецифичную избыточную экспрессию генов, представляющих интерес.

Для анализа больших цис -regulatory регионов, высокого качества большого вставки геномабиблиотеки IC помощью бактериальных искусственных хромосом (БАС) были построены для морских и пресноводных колюшки ^30. Эти BACs можно recombineered заменить ген с флуоресцентным репортерным геном в контексте большой (150-200 кб) геномной области ^31. Флуоресцентный репортер затем выражается в пространственно-временной схеме, что определяется регуляторными последовательностями внутри БАКа. Для исследований в рыбе, сайты Tol2 могут быть добавлены к БАК , чтобы облегчить геномную интеграцию ^32,33. На более поздних стадиях развития , когда гибридизация является технически сложной задачей, флуоресцентное считывание BAC может быть использован для изучения закономерностей экспрессии генов, как было показано для колюшки костного морфогенетического белка 6 (BMP6) ^20. Кроме того, флуоресцентные паттерны экспрессии в личности могут быть отслежены с течением времени, которое не может быть достигнуто с гибридизация. BACs также может быть использован для добавления additionaл копию геномной области, чтобы увеличить дозировку представляющего интерес гена.

Для изучения функции гена, редактирование генома является взрывным расширением поля , которое может быть использовано для получения целевых изменений геномных последовательностей в самых разнообразных организмов ^34. Активатора транскрипции, как эффекторные нуклеазы (Таленс) являются модульными, последовательность конкретных нуклеазы первоначально выделенные из возбудителей болезней растений , которые могут быть точно сконструированных связываться непосредственно с геномной последовательностью выбора и генерировать двойной нити сломать ^35,36. Кластерные регулярно interspaced короткие палиндромные повторы (CRISPR) / системы CAS первоначально были найдены в бактериях и использовать направляющую РНК и белка cas9 генерировать разрыв в последовательности ДНК – мишени , комплементарной направляющей ^37. Последующее ремонт двойного разрыва цепи, созданной обоими Таленс и CRISPRs часто выходит за небольшой вставки или делеции, которые могут нарушить функции последовательности-мишени35-37. В колюшками, Таленс были использованы для срыва экспрессии гена путем ориентации энхансер ^20, и оба Таленс и CRISPRs успешно производят мутации в кодирующих последовательностях (неопубликованные данные). Подробный протокол для генерации CRISPRs для использования в данио рерио могут быть использованы в качестве ориентира для разработки CRISPRs для колюшками ^38.

Трансгенные и геномные эксперименты редактирования требуют введения нуклеиновых кислот в недавно оплодотворенного одноклеточного эмбриона. Путем введения трансгенов или геном-инструмент для редактирования на ранних стадиях развития, число генетически измененных дочерних клеток в эмбрионе максимальна. Введенный эмбрионы затем визуально обследованы на флуоресценцию или молекулярно-скрининг на модификации генома. Если клетки, способствующие зародышевой успешно целенаправленным, трансген или мутация может быть передана к подмножеству потомства, даже тогда, когда после инъекции летальность высока. Мозаичное рыба может быть ауткроссной илискрещивали и потомство их просеивают, чтобы восстановить мутантные аллели или стабильно интегрированный трансген интерес. Этот протокол описывает способы введения трансгенов и генома редактирования реагентов в эмбрионы колюшки одноклеточных и мониторинга для успешных геномных изменений.