Microiniezione per Transgenesi e Genome Editing in Threespine spinarelli

Una componente fondamentale di capire come la biodiversità si pone è la determinazione delle basi genetiche e di sviluppo dei cambiamenti fenotipici evoluti in natura. Il pesce Spinarello, Gasterosteus aculeatus, è emerso come un ottimo modello per studiare le basi genetiche dell'evoluzione. Spinarelli hanno subito molti cambiamenti evolutivi adattativi come i pesci marini hanno colonizzato gli ambienti di acqua dolce innumerevoli intorno nell'emisfero settentrionale, con conseguente morfologica drammatico, fisiologici, e cambiamenti comportamentali ^1. I genomi di individui di ventuno popolazioni stickleback sono stati sequenziati e assemblati, e una mappa linkage alta densità è stato generato per migliorare ulteriormente il gruppo ^2,3. Esperimenti di mappatura genetici hanno identificato regioni genomiche sottostante fenotipi evoluti ^{4 – 6,} e in alcuni casi, i ruoli funzionali di geni specifici sono stati testati ^7,8. Un certo numero di regioni genomiche sottostanti cambiamenti morfologici sono stati identificati con promettenti geni candidati, ma questi candidati non sono ancora stati testati funzionalmente ^{9 – 12.} Inoltre, spinarelli sono modelli comuni per gli studi di genetica delle popolazioni / genomica ^13,14, speciazione ^15, il comportamento ^1, endocrinologia ^16, ecotossicologia ^17, l'immunologia ¹⁸ e parassitologia ^19. Futuri studi in ciascuno di questi settori beneficeranno della possibilità di eseguire manipolazioni genetiche funzionali in spinarelli. Oltre a manipolare le sequenze codificanti, i ruoli dei geni candidati possono essere valutate studiando le loro sequenze -regulatory cis e funzionalmente crescente, decrescente o eliminando espressione del gene candidato. Microiniezione e transgenesi metodi in spinarelli sono ben stabiliti ^7,8,20 e sono stati inizialmente sviluppati utilizzando un meganuclease-mediataMetodo ²¹ descritto per primo nel Medaka ^22. Il metodo microiniezione modificato presentato qui è stato ottimizzato sia per la transgenesi Tol2-mediata e recentemente sviluppato reagenti di modifica del genoma tra Talens e CRISPRs.

Modifiche a cis -regulatory elementi sono pensati per essere critico per l'evoluzione morfologica, come cis -regulatory cambiamenti possono evitare le conseguenze negative pleiotropici di codifica mutazioni ^23. Pertanto, prova e il confronto putative sequenze -regulatory cis è diventato un obiettivo centrale di un numero crescente di studi evolutivi. Inoltre, la maggior parte delle varianti di malattie umane sono varianti normative ^24,25 e sistemi modello vertebrati sono dolorosamente necessari per studiare cis Funzione di un elemento -regulatory e la logica. I pesci che fertilizzare i loro embrioni esternamente in gran numero offrono potenti sistemi di vertebrati a studiare -Regolamento cis. Il sistema di trasposoni Tol2, in cui commDNA gn per essere integrato nel genoma è fiancheggiato da Tol2 trasposasi siti di legame e di co-iniettato con Tol2 trasposasi mRNA, funziona con alta efficienza per l'integrazione con successo plasmide costruisce sui genomi di pesce ^{26 – 28.} In genere, un potenziale Enhancer è clonato a monte di un promotore basale (come hsp70l ²⁹⁾ e del gene reporter fluorescente come EGFP (enhanced green fluorescent protein) o mCherry in una spina dorsale Tol2 e iniettato con trasposasi mRNA ^26. L'osservazione di espressione del reporter fluorescente, sia in embrioni o discendenti con transgeni stabilmente integrati iniettati, fornisce informazioni sulla regolazione spazio-temporale dell'espressione genica guidato dal enhancer putativo. In ulteriori esperimenti, esaltatori validati possono essere utilizzati per guidare sovraespressione tessuto-specifica dei geni di interesse.

Per l'analisi delle più grandi regioni -regulatory cis, di alta qualità genom grande insertolibrerie IC utilizzando cromosomi batterici artificiali (BAC) sono stati costruiti per entrambe le marine e di acqua dolce spinarelli ^30. Questi BAC possono essere recombineered per sostituire un gene con un gene reporter fluorescente nel contesto di un grande (150-200 kb) regione genomica ^31. Il reporter fluorescente viene poi espressa in un modello spazio-temporale, come determinato dal sequenze regolatrici all'interno del BAC. Per gli studi nei pesci, siti Tol2 possono essere aggiunti alla BAC per facilitare genomico integrazione ^32,33. Nelle fasi successive di sviluppo, quando l'ibridazione in situ è tecnicamente impegnativo, la lettura fluorescenza del BAC può essere utilizzato per studiare gli schemi di espressione genica, come è stato dimostrato per stickleback proteina morfogenetica 6 (BMP6) ^20. Inoltre, i modelli di espressione fluorescenti in un individuo possono essere monitorati nel corso del tempo, che non può essere realizzato con l'ibridazione in situ. BAC può essere utilizzato anche per aggiungere un additional copia di una regione genomica di aumentare il dosaggio di un gene di interesse.

Per lo studio della funzione del gene, editing genoma è un campo esplosivo espansione che può essere utilizzato per produrre cambiamenti mirati a sequenze genomiche in un'ampia varietà di organismi ^34. Trascrizione attivatore-come nucleasi effettrici (Talens) sono, nucleasi modulari sequenza-specifiche originariamente isolato da agenti patogeni delle piante che possono essere progettati proprio per legarsi direttamente ad una sequenza genomica di scelta e di generare un doppio filamento pausa ^35,36. Cluster regolarmente intervallati brevi ripetizioni palindromi (CRISPR) / sistemi CAS sono stati originariamente trovati nei batteri e utilizzare un RNA guida e la proteina Cas9 per generare una pausa in una sequenza di DNA bersaglio complementare alla guida ^37. La successiva riparazione della rottura a doppio filamento creato da entrambe le Talens e CRISPRs spesso lascia dietro di sé una piccola inserimento o la cancellazione, che possono interferire con la funzione della sequenza bersaglio35-37. In spinarelli, Talens sono stati utilizzati per distruggere l'espressione genica di mira un potenziatore ^20, ed entrambi Talens e CRISPRs hanno prodotto con successo le mutazioni in sequenze codificanti (dati non pubblicati). Un protocollo dettagliato per la generazione di CRISPRs per l'utilizzo in zebrafish può essere utilizzato come linea guida per sviluppare CRISPRs per spinarelli ^38.

esperimenti di modifica transgenici e genoma richiedono l'introduzione di acidi nucleici in un appena fecondato embrione unicellulare. Con l'introduzione del transgene strumento o del genoma di modifica nelle prime fasi di sviluppo, il numero di cellule figlie geneticamente manipolate in l'embrione è massimizzata. embrioni iniettati vengono poi proiettati visivamente per fluorescenza o molecolarmente sottoposti a screening per le modifiche del genoma. Se le cellule che contribuiscono alla linea germinale sono mirati con successo, il transgene o mutazioni possono essere trasmessi a un sottoinsieme di prole, anche quando post-iniezione letale è elevata. Il pesce a mosaico possono essere outcrossed oincrocia e la loro prole proiettato per recuperare i alleli mutanti o un transgene stabilmente integrata di interesse. Questo protocollo descrive i metodi per l'introduzione di transgeni e l'editing di reagenti genoma in embrioni spinarello uno-cellula e di monitoraggio per le modifiche genomiche di successo.