Microinjection pour transgénèse et Génome Édition dans Épinoche à trois épinoches

Un élément fondamental de comprendre comment la biodiversité se pose est de déterminer les bases génétiques et de développement des changements phénotypiques ont évolué dans la nature. Le poisson épinoche à trois épines, Gasterosteus aculeatus, a émergé comme un excellent modèle pour l' étude de la base génétique de l' évolution. Épinoches ont subi de nombreux changements évolutifs adaptatifs que les poissons marins ont colonisé d' innombrables milieux d'eau douce autour de l'hémisphère nord, ce qui entraîne morphologique dramatique, physiologique, et les changements de comportement ^1. Les génomes des individus de vingt- et -un des populations d'épinoches ont été séquencés et assemblés, et une carte de liaison à haute densité a été générée pour améliorer encore l'ensemble ^2,3. Expériences de cartographie génétique ont identifié des régions génomiques sous – jacente phénotypes évolué ^4-6, et dans quelques cas, les rôles fonctionnels des gènes candidats spécifiques ont été testés ^7,8. Un certain nombre de régions génomiques sous – jacentes des changements morphologiques ont été identifiés avec des gènes candidats prometteurs, mais ces candidats n'a pas encore été testé fonctionnellement ^9-12. En outre, les épinoches sont des modèles communs pour les études de génétique des populations / génomique ^13,14, spéciation ^15, le comportement ^1, l' endocrinologie ^16, écotoxicologie ^17, de l' immunologie ¹⁸ et parasitologie ^19. Les études futures dans chacun de ces domaines bénéficieront de la capacité à effectuer des manipulations génétiques fonctionnels épinoches. En plus de la manipulation de leurs séquences codantes, les rôles des gènes candidats peuvent être évaluées par l' étude de leurs séquences cis -Informations règlementaires et fonctionnellement en augmentant, diminuant ou en éliminant l' expression du gène candidat. Microinjection et transgénèse méthodes épinoches sont bien établies ^7,8,20 et ont d' abord été développés en utilisant une méganucléase à médiationméthode ²¹ décrite en medaka ^22. La méthode de microinjection modifiée présentée ici a été optimisé pour les deux transgénèse Tol2 médiée et récemment mis au point des réactifs de modification du génome, y compris TALENs et CRISPRs.

Les modifications apportées aux éléments de cis sont considérés comme essentiels à l' évolution morphologique, comme les changements de cis peuvent éviter les conséquences pléiotropiques négatifs des mutations ²³ codage. Par conséquent, le test et la comparaison des séquences cis putatifs -Informations règlementaires est devenu un objectif central d'un nombre croissant d'études sur l' évolution. En outre, la plupart des variantes de maladies humaines sont des variantes réglementaires ^24,25, et des systèmes modèles de vertébrés sont cruellement nécessaires pour étudier la fonction de l' élément cis et logique règlementaires. Les poissons qui fertiliser leurs embryons à l' extérieur dans un grand nombre offrent des systèmes de vertébrés puissants pour étudier cis – régulation. Le système de transposon Tol2, dans lequel étranADN gn être intégré dans le génome est flanqué de Tol2 transposase sites et liaison co-injecté avec Tol2 transposase ARNm, fonctionne avec une grande efficacité pour intégrer avec succès le plasmide construit dans les génomes de poisson ^{26 – 28.} En règle générale, un activateur potentiel est cloné en amont d'un promoteur de base (tels que hsp70l ²⁹⁾ et le gène rapporteur fluorescent tel que EGFP (protéine fluorescente verte améliorée) ou mCherry dans un squelette Tol2 et injecté avec transposase ARNm ^26. Observation d'expression du rapporteur fluorescent, soit dans des embryons ou des enfants avec des transgènes intégrés de manière stable injecté, fournit des informations sur la régulation spatio-temporelle de l'expression génique entraînée par l'activateur putatif. Dans d'autres expériences, des amplificateurs validés peuvent être utilisés pour entraîner une surexpression spécifique du tissu de gènes d'intérêt.

Pour l' analyse des régions plus grandes cis -Informations règlementaires, de haute qualité à grande insert genombibliothèques ic utilisant chromosomes bactériens artificiels (BAC) ont été construits pour les deux marins et d' eau douce épinoches ^30. Ces taux d' alcoolémie peuvent être recombineered pour remplacer un gène avec un gène rapporteur fluorescent dans le contexte d'un grand (150-200 kb) ³¹ région génomique. Le rapporteur fluorescent est ensuite exprimé dans un modèle spatio-temporelle tel que déterminé par des séquences régulatrices au sein du BAC. Pour les études dans les poissons, les sites Tol2 peuvent être ajoutés à la BAC pour faciliter l' intégration génomique ^32,33. Dans les stades ultérieurs du développement , lorsque l' hybridation in situ est techniquement difficile, l'affichage fluorescent de BAC peut être utilisé pour étudier les profils d'expression des gènes, comme cela a été montré pour épinoche protéines morphogénétiques osseuses 6 (BMP6) ^20. En outre, les modèles d'expression fluorescents dans un individu peuvent être suivis au fil du temps, qui ne peut être accompli avec l' hybridation in situ. Un TA peut également être utilisé pour ajouter un additional copie d'une région génomique pour augmenter la posologie d'un gène d'intérêt.

Pour l'étude de la fonction des gènes, l' édition du génome est un domaine en expansion explosive qui peut être utilisé pour produire des modifications ciblées à des séquences génomiques dans une grande variété d'organismes ^34. Transcription nucléases effectrices activatrices-like (Talens) sont, nucléases spécifiques de séquence modulaires initialement isolées à partir d' agents pathogènes des plantes qui peuvent être conçus avec précision pour se lier directement à une séquence génomique de choix et de générer un double brin casser ^35,36. Cluster régulièrement intercalées répétitions palindromiques courtes (CRISPR) / systèmes CAS ont été initialement trouvés dans les bactéries et utilisent un ARN guide et la protéine cas9 pour générer une pause dans une séquence d'ADN cible complémentaire au guide ^37. La réparation ultérieure de la double rupture du brin créé par les deux TALENs et CRISPRs laisse souvent derrière une petite insertion ou la suppression, ce qui peut perturber la fonction de la séquence cible35-37. En épinoches, TALENs ont été utilisés pour perturber l' expression des gènes en ciblant un activateur de ^20, et les deux TALENs et CRISPRs ont réussi à produire des mutations dans des séquences (données non publiées) de codage. Un protocole détaillé pour la génération de CRISPRs pour une utilisation chez le poisson zèbre peut être utilisé comme guide pour développer CRISPRs pour épinoches ^38.

Et des expériences transgéniques génome de montage nécessitent l'introduction d'acides nucléiques dans un embryon d'une des cellules nouvellement fécondé. En introduisant l'outil de transgène ou le génome d'édition au début du développement, le nombre de cellules filles génétiquement modifiées dans l'embryon est maximisée. embryons injectés sont ensuite visuellement criblés pour fluorescence ou moléculairement criblées pour des modifications du génome. Si les cellules qui contribuent à la lignée germinale sont ciblés avec succès, le transgène ou la mutation peuvent être transmises à un sous-ensemble de la progéniture, même lorsque la létalité post-injection est élevée. Les poissons de mosaïque peuvent être ou par croisemententrecroisés et leur progéniture tamisé pour récupérer les allèles mutants ou un transgène intégré de manière stable d'intérêt. Ce protocole décrit les méthodes pour introduire des transgènes et des réactifs de modification du génome dans des embryons d'épinoches une cellule et le suivi des modifications génomiques réussies.