الفصل Immunomagnetic من Sca1 الدهون مستودع محددة<sup> عالية</sup> الدهنية المشتقة من الخلايا الجذعية (مخولا لصيانة طائرات)
Summary
We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.
Abstract
The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1high ASCs.
Introduction
الخلايا الجذعية مستضد 1 (Sca1، أو Ly6A / E) كان أول من عرف كعلامة سطح الخلية التي عبرت عنها المكونة للدم والخلايا الجذعية الوسيطة 5،6. جزء الأوعية الدموية اللحمية (صندوق التبرعات الخاص) من الأنسجة الدهنية التي تم الحصول عليها من مستودعات الماوس الدهون هي مجموعة متغايرة من الخلايا التي تتكون من الخلايا الليفية، الضامة، وخلايا بطانة الأوعية الدموية، والخلايا العصبية، وخلايا خلية شحمية السلف 7. الخلايا الاولية خلية شحمية، أو الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة (مخولا لصيانة طائرات) هي خلايا غير الدهون لادن الموجودة في المصفوفة خارج الخلية المحيطة بالأوعية الكولاجين الغني (ECM) 8. ما يقرب من 50٪ من صندوق التبرعات الخاص تتكون من مخولا لصيانة طائرات، والتي وصفها بأنها نسب سلبية (لين -) وCD29 +: CD34 +: Sca1 + 9. معظم هذه الخلايا هي Sca1 +: CD24 – الأسلاف خلية شحمية، والتي هي قادرة على التمايز خلية شحمية في المختبر. ومع ذلك، سوى جزء صغير من الخلايا (0.08٪ من صندوق التبرعات الخاص) يشكل Sca1 <sتصل> +: CD24 + الخلايا التي هي قادرة تماما على المتكاثرة والتفريق في الخلايا الشحمية في ظروف في الجسم الحي 9. وعلى الرغم من التحذير المحتمل لاستخدام Sca1 + صندوق التبرعات الخاص دون تمييز الخلايا CD24 + CD24 من – الخلايا، عزل Sca1 + مخولا لصيانة طائرات من مخازن الدهون باستخدام فصل الخلية immunomagnetic هو نهج فعال وعملي لتحديد النمط الظاهري خلية مستقلة الخلايا الاصلية خلية شحمية الأولية.
في مجال السمنة ومرض السكري، تليف الأنسجة والتهاب تلعب دورا حاسما في تطوير وصيانة النوع 2 من داء السكري 3. في الآونة الأخيرة، توكوناجا وآخرون. أظهرت أن Sca1 خلايا عالية معزولة عن الاربية (أو تحت الجلد، SQ) وperigonadal (أو الحشوية، VIS) C57BL6 / J مستودعات الدهون يحمل توقيعات الجينات المختلفة، وECM إعادة عرض في المختبر 10. MMP14 (MT1-MMP)، وهو عضو تنميط للغشاء تييب] مصفوفة الفلزي (MMP) أسرة تتوسط تطوير الأنسجة الدهنية البيضاء (وات) من خلال النشاط حال للكولاجين ل1.
وتشمل الأمثلة من التجارب التي يمكن أن تجري مع الخلايا المعزولة والتخصيب من خلال بروتوكول التالي ثقافة ثلاثية الأبعاد، دراسات التمايز، المقايسات تدهور الكولاجين، وRNA تسلسل 10،11. وينبغي إجراء فحوصات تدهور مع الكولاجين حمض المستخرجة لضمان الحفاظ على telopeptide 11،12. فإن بروتوكول التالية لشرح طرق لعزل خلايا انسجة الوعائية الأولية من مستودعات الدهون المختلفة، وإثراء الخلايا الاولية خلية شحمية باستخدام فصل الخلية immunomagnetic. وسيتم تقييم صلاحية فرز الخلايا مع التدفق الخلوي ومن خلال استخدام-Sca1 GFP الفئران التي تعبر عن GFP في Sca1 + الخلايا، يقودها Sca1 المروج 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
وهنا علينا أن نبرهن على العزلة والانفصال خلية immunomagnetic من مخولا لصيانة طائرات الفئران من منصات الدهون المختلفة واستخدامها لاجراء تجارب في المختبر. الطريقة المعروضة فعال لعزل سريعة لعدد كبير من مخولا لصيانة طائرات-Sca1 إيجابي، وهو أمر مفيد على العزلة معقدة ومكلفة …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويؤيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة DK095137 (لTHC). نشكر أعضاء المختبر الحاليين والسابقين الذين ساهموا في تنمية وتطور الأساليب المذكورة.
Materials
| Type 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004182 | Tissue digestion |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | High-glucose culture medium |
| Pen/Strep/Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | Media antibiotic |
| Anti-anti (100x) | Gibco | 15240-062 | Media antifungal |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| PBS (1x, pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Trypsin (0.05%) | Gibco | 25300-054 | |
| Cell strainer | BD Bioscience | 352360 | 100-μm cell strainer |
| 60mm plates | BD Falcon | 353004 | |
| Scissors | FST | 14001-12 | Large |
| Scissors | FST | 14091-11 | Fine, curved tip |
| Large Forceps | FST | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Any vendor | ||
| 25G 5/8” needles | BD | 305122 | |
| 22G 1.5” needles | BD | 305159 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| MACS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Sca1 microbead kit (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb |
| AutoMACS running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Blue chux pads | Fisher | 276-12424 | |
| Absorbent pads | Fisher | 19-165-621 | |
| Styrofoam board | Use from 50ml tubes | ||
| 70% ethanol | |||
| Isoflurane | Any vendor | ||
| Rat IgG2a Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
| Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
| Rat IgG2a R-PE | Invitrogen | R2a04 | |
| Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
| Round-bottom tube | BD Falcon | 352058 | |
| HBSS (–Ca, –Mg) | Gibco | 14175-095 | |
| HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | For collagenase solution |
| Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid | Prepare in house12 | ||
| 10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 0.34N NaOH | Prepare in house | ||
| Cover slips | Corning | 2870-22 | |
| Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers | Invitrogen | A-20004 | |
| 0.89M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |
References
- Chun, T. H., et al. A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue. Cell. 125 (3), 577-591 (2006).
- Chun, T. H., et al. Genetic link between obesity and MMP14-dependent adipogenic collagen turnover. Diabetes. 59 (10), 2484-2494 (2010).
- Chun, T. H. Peri-adipocyte ECM remodeling in obesity and adipose tissue fibrosis. Adipocyte. 1 (2), 89-95 (2012).
- Sun, K., Tordjman, J., Clement, K., Scherer, P. E. Fibrosis and adipose tissue dysfunction. Cell Metab. 18 (4), 470-477 (2013).
- Spangrude, G., Heimfeld, S., Weissman, I. Purification and Characterization of Mouse Hematopoietic Stem Cells. Science. 241, 58-62 (1988).
- Welm, B. E., et al. Sca-1(pos) cells in the mouse mammary gland represent an enriched progenitor cell population. Dev Biol. 245 (1), 42-56 (2002).
- Gesta, S., Tseng, Y. H., Kahn, C. R. Developmental origin of fat: tracking obesity to its source. Cell. 131 (2), 242-256 (2007).
- Tang, W., Zeve, D., Suh, J. M., Bosnakovski, D., Kyba, M., Hammer, R. E., Tallquist, M. D., Graff, J. M. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322, 583-586 (2008).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biol. 36, 28-38 (2014).
- Chun, T. H., Inoue, M. 3-D adipocyte differentiation and peri-adipocyte collagen turnover. Methods Enzymol. 538, 15-34 (2014).
- Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
- Ma, X., Robin, C., Ottersbach, K., Dzierzak, E. The Ly-6A (Sca-1) GFP Transgene is Expressed in all Adult Mouse Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells. 20 (6), 514-521 (2002).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nat Cell Biol. 15 (3), 302-308 (2013).
- Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity. Nat Cell Biol. 17 (4), 376-385 (2015).
- Mori, S., Kiuchi, S., Ouchi, A., Hase, T., Murase, T. Characteristic Expression of Extracellular Matrix in Subcutaneous Adipose Tissue Development and Adipogenesis; Comparison with Visceral Adipose Tissue. Int J Biol Sci. 10 (8), 825-833 (2014).
- Ong, W. K., et al. Identification of Specific Cell-Surface Markers of Adipose-Derived Stem Cells from Subcutaneous and Visceral Fat Depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
