הפרדת immunomagnetic של שומן דיפו ספציפי Sca1<sup> גבוה</sup> בתאי גזע שמקורם שומן (ASCs)
Summary
We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.
Abstract
The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1high ASCs.
Introduction
תאי גזע אנטיגן 1 (Sca1, או Ly6A / E) זוהה לראשונה כסמן פני התא הביע על ידי תאים hematopoietic ו גזע mesenchymal 5,6. השבר וסקולרית סטרומה (SVF) של רקמת שומן המתקבלת מאגרי שומן עכבר הוא אוכלוסייה הטרוגנית של תאים הכוללים פיברובלסטים, מקרופאגים, תאי אנדותל של כלי דם, תאים עצביים, ועל ובתאים adipocyte 7. ובתאי adipocyte, או תאי גזע שמקורם שומן (ASCs) הם תאים שאינם שומנים-לאדן כי מתגוררים מטריקס perivascular עשיר קולגן (ECM) 8. כ -50% של SVF מורכב ASCs, המאופיינים שלילי השושלת (לין -) ו CD29 +: CD34 +: Sca1 + 9. רוב של תאים אלה הם Sca1 +: CD24 – אבות adipocyte, המסוגלים בידול adipocyte במבחנה; עם זאת, רק חלק קטן של תאים (0.08% של SVF) מהווה Sca1 <sעד> +: CD24 + תאים המסוגלים מלא של מתרבים ומבדל לתוך adipocytes בתנאים vivo ב 9. למרות הסייגים הפוטנציאל של שימוש Sca1 + SVF ללא אפלית CD24 + תאי CD24 – תאים, לבודד Sca1 + ASCs מן מחסני שומן באמצעות פרדת תא immunomagnetic היא גישה יעילה ומעשית כדי לקבוע את הפנוטיפ-אוטונומי תא של ובתאים adipocyte העיקרי.
בתחום השמנת יתר וסוכרת, סיסטיק לרקמות ודלקת לשחק תפקיד קריטי בפיתוח ותחזוקה של סוכרת מסוג 2 3. לאחרונה, Tokunaga et al. הראה כי תאי גבוה Sca1 המבודד מפשעתי (או תת עורית, SQ) ו perigonadal (או קרבי, VIS) מאגרי שומן C57BL6 / J להפגין חתימות גנטיות שונות שיפוץ ECM במבחנה 10. MMP14 (MT1-MMP), חבר אבטיפוס של-t הממברנהמטלו מטריקס ype (MMP) המשפחה מתווכת בפיתוח שומן לבן (WAT) דרך פעילותה collagenolytic 1.
דוגמאות של ניסויים שעלולים להתנהל עם התאים מבודדים והעשירו באמצעות הפרוטוקול הבא כוללות תרבות תלת ממדים, מחקרי בידול, מבחני שפלת קולגן, ו- RNA רצף 10,11. מבחני שפלה צריכים להתנהל עם קולגן חומצת חילוץ כדי להבטיח את השימור של telopeptide 11,12. הפרוטוקול הבא יהיה להדגים את השיטות לבודדות תאי סטרומה וסקולרית ראשית ממנהל מאגרי שומן שונים ולהעשיר ובתאי adipocyte באמצעות פרדת תא immunomagnetic. תוקפו של מיון התא יוערכו עם זרימת cytometry ובאמצעות באמצעות עכברים Sca1-GFP המבטאים GFP ב Sca1 + תאים, מונע על ידי האמרגן Sca1 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
בזאת אנו מדגימים את הבידוד והפרדה תא immunomagnetic של ASCs בעכברים מ רפידות שומן שונים והשימוש בהם לניסויים במבחנה. השיטה המוצגת היא יעילה עבור הבידוד המהיר של מספר רב של ASCs Sca1 החיובי, המהווה יתרון על FACS בתיווך מורכב ויקר טכניים הבידוד של ASCs 9,14. בניגוד FACS, הפרדת תא im…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי NIH DK095137 (עד THC). אנו מודים לחברי המעבדה בהווה ובעבר אשר תרמו להתפתחות והתחכום של השיטות שתוארו.
Materials
| Type 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004182 | Tissue digestion |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | High-glucose culture medium |
| Pen/Strep/Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | Media antibiotic |
| Anti-anti (100x) | Gibco | 15240-062 | Media antifungal |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| PBS (1x, pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Trypsin (0.05%) | Gibco | 25300-054 | |
| Cell strainer | BD Bioscience | 352360 | 100-μm cell strainer |
| 60mm plates | BD Falcon | 353004 | |
| Scissors | FST | 14001-12 | Large |
| Scissors | FST | 14091-11 | Fine, curved tip |
| Large Forceps | FST | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Any vendor | ||
| 25G 5/8” needles | BD | 305122 | |
| 22G 1.5” needles | BD | 305159 | |
| 15 ml conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| MACS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Anti-Sca1 microbead kit (FITC) | Miltenyi Biotec | 130-092-529 | FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb |
| AutoMACS running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Blue chux pads | Fisher | 276-12424 | |
| Absorbent pads | Fisher | 19-165-621 | |
| Styrofoam board | Use from 50ml tubes | ||
| 70% ethanol | |||
| Isoflurane | Any vendor | ||
| Rat IgG2a Alexa Fluor 647 | Invitrogen | R2a21 | |
| Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647 | Invitrogen | MSCA21 | |
| Rat IgG2a R-PE | Invitrogen | R2a04 | |
| Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE | Invitrogen | MF48004 | |
| Round-bottom tube | BD Falcon | 352058 | |
| HBSS (–Ca, –Mg) | Gibco | 14175-095 | |
| HBSS (+Ca, +Mg) | Gibco | 14025-092 | For collagenase solution |
| Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid | Prepare in house12 | ||
| 10x MEM | Gibco | 11430-030 | |
| 1M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 0.34N NaOH | Prepare in house | ||
| Cover slips | Corning | 2870-22 | |
| Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers | Invitrogen | A-20004 | |
| 0.89M NaHCO3 | Gibco | 25080-094 |
References
- Chun, T. H., et al. A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue. Cell. 125 (3), 577-591 (2006).
- Chun, T. H., et al. Genetic link between obesity and MMP14-dependent adipogenic collagen turnover. Diabetes. 59 (10), 2484-2494 (2010).
- Chun, T. H. Peri-adipocyte ECM remodeling in obesity and adipose tissue fibrosis. Adipocyte. 1 (2), 89-95 (2012).
- Sun, K., Tordjman, J., Clement, K., Scherer, P. E. Fibrosis and adipose tissue dysfunction. Cell Metab. 18 (4), 470-477 (2013).
- Spangrude, G., Heimfeld, S., Weissman, I. Purification and Characterization of Mouse Hematopoietic Stem Cells. Science. 241, 58-62 (1988).
- Welm, B. E., et al. Sca-1(pos) cells in the mouse mammary gland represent an enriched progenitor cell population. Dev Biol. 245 (1), 42-56 (2002).
- Gesta, S., Tseng, Y. H., Kahn, C. R. Developmental origin of fat: tracking obesity to its source. Cell. 131 (2), 242-256 (2007).
- Tang, W., Zeve, D., Suh, J. M., Bosnakovski, D., Kyba, M., Hammer, R. E., Tallquist, M. D., Graff, J. M. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322, 583-586 (2008).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Tokunaga, M., et al. Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells. Matrix Biol. 36, 28-38 (2014).
- Chun, T. H., Inoue, M. 3-D adipocyte differentiation and peri-adipocyte collagen turnover. Methods Enzymol. 538, 15-34 (2014).
- Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
- Ma, X., Robin, C., Ottersbach, K., Dzierzak, E. The Ly-6A (Sca-1) GFP Transgene is Expressed in all Adult Mouse Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells. 20 (6), 514-521 (2002).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nat Cell Biol. 15 (3), 302-308 (2013).
- Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity. Nat Cell Biol. 17 (4), 376-385 (2015).
- Mori, S., Kiuchi, S., Ouchi, A., Hase, T., Murase, T. Characteristic Expression of Extracellular Matrix in Subcutaneous Adipose Tissue Development and Adipogenesis; Comparison with Visceral Adipose Tissue. Int J Biol Sci. 10 (8), 825-833 (2014).
- Ong, W. K., et al. Identification of Specific Cell-Surface Markers of Adipose-Derived Stem Cells from Subcutaneous and Visceral Fat Depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
