Mechanismus der Regulierung der Adipocyte Zahlen in adulten Organismen durch Differenzierung und Apoptosis Homöostase
Summary
Adipose tissue (AT) can influence whole body homeostasis, therefore understanding the molecular mechanisms of adipocyte differentiation and function is of importance. We provide a protocol for gaining new insights into these processes by analyzing adipocyte homeostasis, differentiation and hypoxia exposure as a model for induced adipocyte apoptosis.
Abstract
Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of adipocytes, which in turn induces abnormal secretion of adipokines, triggering metabolic syndromes such as obesity, dyslipidemia, hyperglycemia, hyperinsulinemia, insulin resistance and type 2 diabetes. Therefore, investigating the molecular mechanisms behind adipocyte dysregulation could help to develop novel therapeutic strategies. Our protocol describes methods for evaluating the molecular mechanism affected by hypoxic conditions of the AT, which correlates with adipocyte apoptosis in adult mice. This protocol describes how to analyze AT in vivo through gene expression profiling as well as histological analysis of adipocyte differentiation, proliferation and apoptosis during hypoxia exposure, ascertained through staining of hypoxic cells or HIF-1α protein. Furthermore, in vitro analysis of adipocyte differentiation and its responses to various stimuli completes the characterization of the molecular pathways behind possible adipocyte dysfunction leading to metabolic syndromes.
Introduction
Nach dem 2014 Bericht der Weltgesundheitsorganisation, 39% der erwachsenen Weltbevölkerung ist übergewichtig und 13% ist fettleibig 1. In naher Zukunft wird übergewichtigen Menschen einen signifikanten Anteil der älteren Bevölkerung umfassen. Ein wichtiges Merkmal von Fettleibigkeit und Alterung ist Dysregulation von Fett in Bezug auf Morbidität und Mortalität 2. Adipokines, Proteine , die durch das Fettgewebe (AT) sezerniert wird , kann metabolische Syndrome wie Fettleibigkeit auslösen und 2 – Diabetes Typ 3. Stoffwechselerkrankungen werden meist durch zu hohe Energiespeicherung in den Lipidtröpfchen von Adipozyten verursacht, die 4 bei Expansion führt. Es ist daher von Interesse, die Ursachen und die molekularen Mechanismen der AT Expansion, um zu bestimmen, Möglichkeiten zu finden, sie zu kontrollieren.
Überernährung führt zu Expansion an, die durch zwei Ereignisse geregelt wird: übermäßige Energiespeicher in die Lipidtröpfchen von Adipozyten, ein Prozesswas zu einer Hypertrophie (Zunahme der Adipozyten – Größe) und erhöhte adipogenesis, die auch als Adipozyten Hyperplasie 5 bekannt. Adipogenese ist ein Prozess der Differenzierung der multipotenten mesenchymalen Stammzellen (MSC) in Adipozyten. Erstens entwickeln MSCs in Preadipozyten während der Verpflichtungsphase. Zweitens unterscheiden Preadipozyten weitere 6 die Eigenschaften reifen und funktionellen Adipozyten zu erwerben. Mehrere Transkriptionsfaktoren wurden als Masterregler für Preadipozyten Bestimmung, wie Zinkfinger-Protein 423 (Zfp423) und frühen B-Zell-Faktor 1 (EBF1) identifiziert. Während Zfp423 frühen Einsatz induziert wird EBF1 6 zur Erzeugung von Adipozyten – Vorläufern erforderlich. Terminale Differenzierung ist eng durch einen Transkriptions Kaskade gesteuert, wodurch Peroxisomenproliferator-aktivierten Rezeptor γ (PPAR) ist der wesentliche Transkriptionsfaktor 7. Weitere wichtige Transkriptionsfaktoren sind die CCAAT / Enhancer-bindendes Protein (C/ EBP) Familienmitglieder (dh C / EBP & agr, C / EBPβ und C / EBPδ) Kruppel artige Faktoren (KLFs), responsive element cAMP – Bindungsprotein (CREB) und frühe Wachstumsantwort 20 (Krox20) 6.
Vor kurzem wurde gezeigt , dass das Aktivatorprotein-1 (AP-1) -Familie im Adipozyten – Differenzierungsprozess 8,9 beteiligt ist. Die AP-1-Familie wird von einem dimeren Protein-Komplex gebildet, bestehend aus Fos, Jun und / oder aktivierende Transkriptionsfaktor (ATF) Mitglieder. Fos-verwandtes Antigen 1 und 2 (Fra-1 und Fra-2) sind in der Lage Adipozyten-Differenzierung zu regulieren. Fra-1 beeinträchtigt Adipocytendifferenzierung von C / EBP & agr 8, während Fra-2 steuert Adipozyten Umsatz 9 hemmen. Fra-2 dadurch nicht verringert nur die Adipozyten-Zahl von PPARγ2 Expression während der Adipozyten-Differenzierung drücken, sondern verringert auch die Adipozyten Apoptose durch direkte Unterdrückung von Hypoxie-induzierbaren Faktoren (HIFs) Ausdruck. Die HIF-Familie ist eine heterodimeric Transkriptionsfaktor-Komplex, bestehend aus HIF-1α, HIF-2α und HIF-1β. Die Heterodimere bestehen aus einem sauerstoffempfindlichen HIF-α Protein (HIF-1α oder HIF-2α) und dem Sauerstoff-unempfindlichen HIF-1β – Untereinheit 10. Während Normoxie HIF-α – Proteine sind Poly-ubiquitiniert und werden schließlich durch das Proteasom 11 abgebaut. Unter hypoxischen Bedingungen tritt bei bei der Expansion, HIF-α-Proteine sind nicht mehr hydroxylierten. Sie sind daher stabilisiert und Form werden Dimere mit dem konstitutiv exprimiert HIF-1β. Transkriptioneller Aktivierung von Genen durch die HIF – Response – Elemente gesteuert ist , die an der Regulation der Angiogenese, Metabolismus und Entzündung 12. Tatsächlich fördert die HIF-1α AT Dysfunktion durch Glukosetoleranz zu induzieren, den Energieverbrauch und peripheren Verwendung von Lipid Hemmen sowie durch Leptin Niveau erhöht und HFD-induzierten 13 Hepatosteatose. Außerdem HIF-1α reguliert adipocyte Apoptose in vivo und in vitro 9.
Das vorliegende Protokoll beschreibt Methoden für AT Status der Untersuchung der molekularen Eigenschaften von Adipozyten-Homöostase in erwachsenen Mäusen zu entwirren. Es zeigt , wie der Apoptose, Proliferation und Differenzierung von Adipozyten in vivo und in vitro kann durch Hypoxie reguliert werden. Dazu verwenden wir Mäuse mit Adipozyten spezifischen Deletion von Fra-2 erzeugt durch Mäusen , die die Fra-2 floxed Allele mit FABP4-CreERT Mäuse 9 kreuzen. FABP4-Cre ERT Mäuse Durch die Verwendung der Löschung ist Adipozyten spezifische und induzierbare durch Tamoxifen Injektion 14. Für die Erwachsenen-Modell, intraperitoneale Injektionen von Tamoxifen durchgeführt werden mehr als 5 aufeinander folgenden Tagen im Alter von 6 Wochen beginnen. Somit werden die Mäuse für 6 Wochen zu einer normalen Ernährung oder hohen Fett-Diät unterzogen, bevor die Analyse durchgeführt wird. Die Mäuse in dieser Studie verwendet wurden männliche basierend auf einem C57Bl6 Hintergrund weibliche Hormone zu vermeiden, wie ÖstrogeneDargestellt , um die Körperfettverteilung 15 zu regulieren. Eine andere genetische Hintergrund verwenden , kann auch die metabolischen Phänotyp verändern, aufgrund dehnungsbedingte Unterschiede in Lipidmanagement 16.
Dieses Protokoll zeigt , wie AT unter Hypoxie zu analysieren Histologie verwenden und wie Adipozyten Apoptose, Proliferation und Differenzierung in vivo mittels Immunhistochemie und Gen Profilierungs Analysen zu quantifizieren. Die Studie wird von in – vitro – Experimente abgeschlossen, die zeigen , wie primären Adipozyten – Differenzierung und Apoptose durch Exposition gegenüber Hypoxie verändert zu analysieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adipozyten sind phänotypisch charakterisiert durch ihre Größe, Anzahl und Fläche, Adipozyten Hyperplasie und Hypertrophie offenbart, die durch übermäßige Energiespeicher induziert durch Überernährung 5. Diese Ereignisse, die zu Fettsäure Dysregulation und anschließende Metabolisches Syndrom sind auch Zustände erhöhter Fettmasse mit erhaltenen Metabolismen, die auch als "gesund" Fett Expansion bezeichnet wird. Zum Beispiel Kusminski et al. 21 zeigten , dass Mäuse , die mit massiven Fettexpansions metabolisch gesund bleiben, was darauf hindeutet , dass Fett Expansion nicht notwendigerweise auf Metabolisches Syndrom verbunden ist und sein muss sorgfältig bestimmt , um die Eigenschaften der Adipozyten zu bewerten. Das Fettgewebe (AT) spielt eine zentrale Rolle bei der Regulation des Körpermetabolismus. AT ist die größte endokrine Organ , das Dyslipidämie, Atherosklerose, Hyperinsulinämie und Hyperglykämie 3 beeinflussen könnten. Auswertung der AT-Homöostase und der molekularen mechanisms es regulieren könnte ein besseres Verständnis der Stoffwechselsystem Störungen ermöglichen. Daher die Regulierungsmechanismen Adipocytendifferenzierung entwirren, Adipozyten Größe und Fettpolster Masse würde dazu beitragen, neue therapeutische Behandlung von Fettleibigkeit Störungen zu entwickeln. Verwendung von in vivo und in vitro Verfahren ist es möglich , die Rolle der Nahrung und die Genexpression Auswirkungen auf die Adipozyten – Differenzierung und Aktivität zu bestimmen. Um die AT – Homöostase, die Bestimmung der im Gleichgewicht zwischen Adipozyten Differenzierung, Proliferation und Apoptose bestimmen , wie vorgeschlagen durch unser Protokoll so wichtig ist wie die Glucose- und Insulinstoffwechselantwort 22-24 analysiert.
Expressionsprofilen Analysen von Genen in Adipogenese beteiligt, Lipogenese, Lipolyse, Fettsäureaufnahme, Hypoxie, Apoptose und Proliferation in primären Adipozyten und viszeralen AT ist ein Hochdurchsatzverfahren zum Erhalten einer Übersicht über adipocyte Homöostase und deren mögliche Dysfunktion.Interessante Kandidaten sollten weiter auf Proteinebene durch Western-Blot oder immunhistologische Färbung analysiert werden. Um optimale Ergebnisse durch PCR-System in Echtzeit erhalten, unter Verwendung von unsymmetrischen Cyaninfarbstoffen, reichen die Konzentrationen von cDNA von 1 bis 10 ng und die optimale Primerkonzentrationen im Bereich von 50 bis 900 nm sollte zur Minimierung unspezifischer Amplifikation getestet werden. Die kritischen Komponenten sind die Primer; für jeden Lauf, müssen die Schmelzkurven, die Spezifität zu gewährleisten und schließen die Bildung von Primer-Dimeren streng kontrolliert werden. Daher wird eine negative Kontrolle mit H 2 O anstelle von cDNA unter Verwendung empfohlen. Weiterhin handelsübliche unsymmetrischen Cyanin-Farbstoffe werden als Master-Mischungen bereitgestellt, die eine passive Referenzfarbstoff (wie ROX) enthalten ein internes Referenzsignal zu liefern. Das cDNA-Signal wird während der Datenanalyse zu den ROX Signale normalisiert gut zu Well Signalschwankungen zu korrigieren. Ein weiterer Punkt zu berücksichtigen, um eine Schmiere zu etablierend qPCR System ist die Wahl des Housekeeping-Gens. Für jede Bedingung sind verschiedene Housekeeping – Genen verwendet, beispielsweise HPRT, β-Aktin, GAPDH, β-2-MG oder HSP90.
HIF Proteine stabilisiert durch hypoxischen Bedingungen sind Master – Regula Bestimmung nicht nur Adipozyten Überleben, aber auch Stoffwechselveränderungen, beispielsweise Glukose, Insulintoleranz und Lipidstoffwechsel 11,25,26. Um hypoxische Bereiche in das Fettpolster, HIF-1α wird bestimmt in AT Abschnitte durch Immunhistochemie ermitteln. Da HIF Proteine schnell in 5 bis 10 min unter normoxischen Bedingungen abgebaut werden, sollte das Verfahren und die Fixierung des Fettpolsters für die histologische Analyse gesteuert werden eng Latenzzeit zu vermeiden. Daher Hypoxie nicht nur durch HIF-Färbung zu gewährleisten, wird pimonidazole verwendet hypoxischen Bereichen in der AT bestimmen. Pimonidazole der Lage ist , in das Gewebe zu verteilen, wie es bereits in den Knochen gezeigt wurde 27Und markieren Sie effektiv hypoxische Bereiche durch zu thiolhaltigen Proteine spezifisch in hypoxischen Zellen binden, die weiter in histologischen Schnitten durch spezifische Antikörperbindung 28 erfasst wird. Jedoch können auch andere Marker und Methoden verwendet werden, um die Hypoxie Stoffwechselweg zu analysieren. Zum Beispiel ist die Beteiligung der Prolylhydroxylasedomäne (PHD) Enzym, das die Hydroxylierung von Prolin-Reste unter Normoxie induzieren, sowie der von Hippel-Lindau (VHL) Protein, das hydroxylierte Proline erkennen und induzieren die Poly-Ubiquitinierung proteasomaler HIF zu vermitteln Abbau, müssen für eine vollständige Übersicht über den Weg 29,30 analysiert werden. Außerdem allgegenwärtigen Nachweis von HIFs würde bestimmen auch die Proteinstabilität und Abbau , die 31,32 werden verändern können.
Proliferation von Ki67 und Apoptose durch TUNEL – Färbung Weiterhin werden in vivo durch Färbung von AT histologischen Schnitten bestimmt. Die Quantifizierung der Proliferation von Ki67 und einpoptosis durch TUNEL oder Annexin V – Färbung durch Durchflusszytometrie – Analyse wird auch 33 durchgeführt. Proliferation könnte natürlich durch andere Techniken, wie die Analysen der Adipozyten-Zellzyklus gemessen werden, die nicht durch die Messung von Ki67 positive Zellen gerichtet. Darüber hinaus kann die Apoptose Studie von TUNEL abgeschlossen werden durch FACS von Annexin V-Analysen und TOP-PR-3, die das Niveau der Nekrose gegenüber der Apoptose Zelltod Prozess bestimmen wird. Apoptosis ist ein fundamentaler Prozess für das Programm des Zelltods, der für AT Homöostase wichtig ist. Tatsächlich Dysregulation von Adipozyten Apoptose in Prozessen bisher verwickelt zu Fettleibigkeit beitragen und 34 Lipodystrophie. Darüber hinaus im Jahr 2011, Keuper et al. Fettgewebe Entzündung zu Adipozyten Apoptose verknüpft. Sie zeigten, dass Makrophagen induzierte Apoptose in Präadipozyten und Adipozyten, die wiederum Makrophagen ziehen. Die Rekrutierung von Makrophagen beschleunigt Entzündung, die contributes metabolischen Syndromen wie Glucose und Insulintoleranz 35. Allerdings ist Adipozyten Apoptose noch ein wenig untersucht Phänomen, trotz der Hypothese, dass die induzierte Adipozyten Apoptose zu einer verminderten Gewichts führen könnte.
Die vorliegende Protokoll verwendet immunhistochemischen Methoden unterschiedliche Phänomene wie Proliferation, Apoptose und Hypoxie in vivo zu untersuchen. Daher wurde das Gewebe mit 4% Formaldehyd fixiert, was ein kritischer Schritt. Eine erweiterte Gewebefixierungszeit führt der Epitope zu ändern, die für den Antikörper nicht zugänglich. Im Gegensatz dazu erhöht eine kurze Fixierzeit die Empfindlichkeit der Epitope Reagenzien. Die empfohlene optimale Zeitpunkt der Fixierung ist 24 Stunden. Darüber hinaus beeinflusst die Dicke der Abschnitte auch die Antikörper an ihre Epitope binden; optimale Dicke liegt zwischen 2 und 5 um. Abschnitte dicker als 5 & mgr; m erhalten falsch-positive Ergebnisse aufgrund der erhöhten Bindungsstellen. Im Gegensatz, sexionen dünner als 2 um enthalten weniger Bindungsstellen und positive Bereiche sind nicht gut definiert. Weitere wichtige Faktoren sind die Antikörper selbst, Inkubationszeit, Konzentration und gleichmäßige Temperatur, die die Qualität der spezifischen Bindung an die Epitope beeinflussen. Daher ist die Antikörperkonzentration und Inkubationszeit Validierung für jede Bedingung notwendig.
Um die Studie abgeschlossen ist , stellen wir ein in vitro Adipozytendifferenzierung Protokoll, die durch verschiedene Behandlungen, Stimulation oder Co-Kulturen ausgedehnt werden könnte. Durch die Verwendung von in vitro – Kulturen Adipozyten, ist es möglich , Defekte in Adipozyten – Differenzierung und Funktionen zu bestimmen. Um erhalten zuverlässige Ergebnisse, wie für alle primären Zellen, die gesundes Verhalten und Aussehen der ADSCs und Adipozyten ganz wichtig ist. Die Granularität, zytoplasmatische vacuolations und / oder Ablösung sind Anzeichen für eine Verschlechterung, was auf unzureichende Medium, eine mikrobielle Kontamination oder Seneszenz des primärenZellen. Dieses Protokoll wird unter Verwendung von isolierten Adipozyten aus dem Fettpolster Gewebe, während es auch möglich ist , mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmark , wie 36 von anderen Protokollen isoliert zu verwenden. Die neueste Stroma-Vorläuferzellen enthält, die in einem sehr frühen Schritt der Adipozyten-Differenzierung auftretende zusätzliche Differenzierung Probleme widerspiegeln könnte, könnte dies in unserem aktuellen Protokoll fehlen. Darüber hinaus kann ADSCs schnell erweitert werden (mehr als 10 Mal innerhalb einer Woche), und langfristige kultiviert ADSCs nach einigen Passagen noch ihre mesenchymalen Pluripotenz 37,38 behalten. Ein weiterer Vorteil ADSCs ist, dass man leicht auf die menschliche schalten kann, kann, da ADSCs von Patienten durch Liposuktion geerntet werden, die eine einfache und minimal-invasive Methode.
Wie in mehreren anderen Organen in einer endokrinen Weise beeinflusst, sollte das Protokoll zu adipokines erweitert werden. Adipokinen, wie Leptin, Adiponectin, Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF) and resistin, von Adipozyten sezerniert werden bekannte Stoffwechselerkrankungen zu beeinflussen , indem sie den Fettstoffwechsel, Energie – Homöostase und Insulin – Empfindlichkeit Steuerung 39. Daher sollten Analysen Serum und Adipozyten Sekretom ausgeführt werden. Im Falle von Funktionsstörungen AT, adipokines und proinflammatorische Zytokine, wie IL-6, kann zu Fehlregulation von Organen führen, wie der Leber und Bauchspeicheldrüse und der Muskelfunktion 4. Um systemische Organdysfunktion auszuschließen, Tiermodelle oder Zellkulturen auf ihre Reaktion könnte getestet, um Stimulation und Aufnahme Glukose.
Hier bieten wir ein Protokoll für den Grundzustand des AT Analyse und Adipozyten in vivo und in vitro molekularen Mechanismen der Adipozyten – Homöostase und Funktionalität zu offenbaren.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. J. Luther und K. Ubieta die Daten und Dr. B. Grötsch für die Vorbereitung für das Korrekturlesen des Manuskripts zu freundlich danken. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (BO3811 / 1-1-Emmy Noether).
Materials
| RNAlater solution | Ambion | AM7021 | RNA stabilization solution |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| SYBR Select Master Mix | 4472908 | ||
| Purified Mouse Anti-Human Ki-67 | BD Biosciences | 550609 | Clone B56 (RUO) |
| Purified Mouse Anti-Human Ki-67 Clone B56 (RUO) | 550609 | Proliferation marker | |
| FITC Annexin V | BioLegend | 640906 | |
| Cleaved Caspase-3 Rabbit mAb | Cell signalling | 9664S | Clone 5A1E |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | 9664 | Apoptosis marker | |
| Hypoxyprobe-1 Plus Kit | Hypoxyprobe | HP2-200Kit | Hypoxia marker, Solid pimonidazole HCl (Hypoxyprobe-1), FITC conjugated to mouse IgG₁ monoclonal antibody (FITC-MAb1), Rabbit anti-FITC conjugated with horseradish peroxidase |
| Lipofectamine2000 Reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
| TO-PRO-3 Iodide | T3605 | Nuclear counterstain, Monomeric cyanine nucleic acid stain, Excitation⁄Emission: 642⁄661 nm | |
| Mayer’s hemalum | Merck | 109249 | hematoxylin |
| pegGOLD TriFast | Peqlab | 30-2030 | TRIzol, single-phase solution of guanidinisothiocyanat and phenol |
| Percellys Ceramic Kit 1.4 mm | 91-PCS-CK14 | tubes containing ceramic beads (1.4 mm) | |
| Precellys 24 | 91-PCS24 | homogenizer | |
| HIF-1 alpha Antibody | Pierce | PA1-16601 | |
| HIF-1 alpha Antibody, 16H4L13 | 700505 | Hypoxia marker | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein | Roche | 11 684 795 001 | TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) |
| Eosin | Sigma | 318906 | |
| DNase I Solution (1 unit/µL) | Thermo Scientific | EN0525 | |
| biotinylated anti mouse IgG (H+L) | Vector Laboratories | BA-9200 | |
| biotinylated anti mouse IgG (H+L) | BA-1000 | ||
| Vectastain ABC Kit | PK-4000 | ||
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | H-1200 |
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