Mechanisme van de verordening van Adipocyte Numbers in volwassen organismen door differentiatie en apoptose Homeostasis
Summary
Adipose tissue (AT) can influence whole body homeostasis, therefore understanding the molecular mechanisms of adipocyte differentiation and function is of importance. We provide a protocol for gaining new insights into these processes by analyzing adipocyte homeostasis, differentiation and hypoxia exposure as a model for induced adipocyte apoptosis.
Abstract
Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of adipocytes, which in turn induces abnormal secretion of adipokines, triggering metabolic syndromes such as obesity, dyslipidemia, hyperglycemia, hyperinsulinemia, insulin resistance and type 2 diabetes. Therefore, investigating the molecular mechanisms behind adipocyte dysregulation could help to develop novel therapeutic strategies. Our protocol describes methods for evaluating the molecular mechanism affected by hypoxic conditions of the AT, which correlates with adipocyte apoptosis in adult mice. This protocol describes how to analyze AT in vivo through gene expression profiling as well as histological analysis of adipocyte differentiation, proliferation and apoptosis during hypoxia exposure, ascertained through staining of hypoxic cells or HIF-1α protein. Furthermore, in vitro analysis of adipocyte differentiation and its responses to various stimuli completes the characterization of the molecular pathways behind possible adipocyte dysfunction leading to metabolic syndromes.
Introduction
Volgens het rapport van de World Health Organization 2014, 39% van 's werelds volwassen bevolking lijdt aan overgewicht en 13% zwaarlijvig is 1. In de nabije toekomst zullen mensen met overgewicht een belangrijk deel van de oudere bevolking omvatten. Een belangrijk kenmerk van obesitas en veroudering ontregeling van vet in relatie tot morbiditeit en mortaliteit 2. Adipokines, eiwitten gesecreteerd door vetweefsel (AT), kan leiden metabool syndroom, zoals obesitas en type 2 diabetes 3. Stofwisselingsziekten worden meestal veroorzaakt door overmatige energieopslag in de vetdruppels van adipocyten, waardoor AT expansie 4. Het is daarom van belang om de oorzaken en de moleculaire mechanismen van AT expansie te bepalen met het oog op de mogelijkheden om het onder controle te vinden.
Over-voeding leidt tot AT uitbreiding, die wordt geregeld door twee gebeurtenissen: overmatige opslag van energie in de vetdruppels van adipocyten, een proceswaardoor hypertrofie (toename van adipocyten grootte) en verhoogde adipogenese, ook bekend als adipocyten hyperplasie 5. Adipogenese is een proces van differentiatie van multipotente mesenchymale stamcellen (MSC) tot adipocyten. Ten eerste, MSC's zich ontwikkelen tot preadipocyten tijdens de inzet fase. In de tweede plaats, preadipocyten verder te differentiëren naar de kenmerken van de volwassen en functionele adipocyten 6 te verwerven. Verscheidene transcriptiefactoren zijn geïdentificeerd als master regelaars voor preadipocyt bepaling, zoals zinkvingereiwit 423 (Zfp423) en vroege B-cel factor 1 (Ebf1). Overwegende Zfp423 induceert vroege betrokkenheid, is Ebf1 nodig is voor het genereren van adipocyten voorlopers 6. Terminale differentiatie wordt streng gecontroleerd door een transcriptionele cascade, waarbij peroxisoom proliferator geactiveerde receptor γ (PPARy) is de essentiële transcriptiefactor 7. Andere belangrijke factoren zijn de transcriptie CCAAT / enhancer-bindend eiwit (C/ EBP) familieleden (dat wil zeggen, C / EBPα, C / EBPB en C / EBPδ), Krüppel-achtige factoren (KLFs), cAMP responsief element-bindend eiwit (CREB) en vroege groei respons 20 (Krox20) 6.
Recentelijk is aangetoond dat de activator proteïne-1 (AP-1) familie is betrokken bij de adipocyten differentiatieproces 8,9. De AP-1 familie wordt gevormd door een dimeer eiwitcomplex, samengesteld Fos, Jun en / of activerende transcriptiefactor (ATF) leden. Fos-gerelateerde antigen 1 en 2 (Fra-1 en Fra-2) kunnen adipocytdifferentiatie regelen. Fra-1 schaadt adipocytdifferentiatie door remming van C / EBPα 8, terwijl Fra-2 controles adipocyten omzet 9. Fra-2 daarbij niet alleen vermindert het aantal vetcellen door het onderdrukken van PPARγ2 expressie tijdens differentiatie van adipocyten, maar vermindert ook adipocyten apoptose door middel van directe onderdrukking van hypoxie-induceerbare factoren (HIFs) expressie. Het HIF familie is een heterodimeric transcriptiefactor complex, bestaande uit HIF-1α HIF-2α en HIF-1β. De heterodimeren bestaan uit een zuurstofgevoelige HIF-α eiwit (HIF-1α en HIF-2α) en het zuurstof-ongevoelige HIF-1β subeenheid 10. Tijdens normoxia, HIF-α eiwitten poly-ubiquitinylated en worden uiteindelijk afgebroken door proteasomen 11. Onder hypoxische omstandigheden bij ten tijdens expansie, HIF-α eiwitten niet meer gehydroxyleerde. Zij derhalve gestabiliseerd en dimeren vormen met constitutief tot expressie HIF-1β worden. Transcriptionele activering van genen beheerst door de HIF responselementen is betrokken bij de regulatie van angiogenese, metabolisme en ontsteking 12. Inderdaad, HIF-1α bevordert AT dysfunctie door het induceren glucosetolerantie remmen energieverbruik en perifere gebruik van lipide, en door verhogen leptinespiegel en HFD-geïnduceerde hepatische steatosis 13. Bovendien HIF-1α regelt adipocyte apoptose in vivo en in vitro 9.
Het huidige protocol beschrijft methoden voor het bestuderen van AT status aan de moleculaire eigenschappen van adipocyten homeostase te ontrafelen in volwassen muizen. Het laat zien hoe apoptosis, proliferatie en differentiatie van adipocyten in vivo en in vitro kan worden gereguleerd door hypoxie. Om dit te doen, maken we gebruik van muizen met adipocyten specifieke deletie van Fra-2 geproduceerd door het kruisen van muizen die het Fra-2 floxed allelen met Fabp4-CreERT muizen 9. Door het gebruik van Fabp4-Cre ERT muizen, de verwijdering is adipocyten specifiek en geïnduceerd door tamoxifen injectie 14. Voor de volwassen model worden intra peritoneale injecties van tamoxifen uitgevoerd meer dan 5 opeenvolgende dagen vanaf de leeftijd van 6 weken. Aldus worden de muizen onderworpen aan een normaal dieet of een vetrijk dieet gedurende 6 weken voordat de analyse wordt uitgevoerd. De muizen gebruikt in deze studie werden mannelijke gebaseerd op een C57Bl6 achtergrond vrouwelijke hormonen zoals estrogenen voorkomen, Aangetoond dat de verdeling van lichaamsvet 15 reguleren. Een andere genetische achtergrond Ook veranderen de metabole fenotype, door stam-gerelateerde verschillen in lipide beheer 16.
Dit protocol laat zien hoe AT analyseren onder hypoxie met behulp van histologie en hoe adipocyten apoptose, proliferatie en differentiatie in vivo te kwantificeren met behulp van immunohistochemie en gen profilering analyses. Het onderzoek is voltooid door in vitro experimenten laten zien hoe primaire adipocyten differentiatie en apoptose veranderd door blootstelling aan hypoxie analyseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adipocyten worden fenotypisch gekenmerkt door hun grootte, aantallen en het gebied, het onthullen van vetcellen hyperplasie en hypertrofie, geïnduceerd door overmatige opslag van energie als gevolg van over-voeding 5. Deze gebeurtenissen leiden tot vetzuur dysregulatie en daaropvolgende metabool syndroom ook bepaald verhoogde vetmassa met gekonfijte metabolisme, die ook wordt aangeduid als "gezond" fat expansie. Bijvoorbeeld Kusminski et al. 21 aangetoond dat muizen met massieve dikke expansie blijven metabolisch gezonde, wat suggereert dat vet expansie niet beperkt hoeft te metabool syndroom en moet zorgvuldig bepaald om de eigenschappen van de adipocyten evalueren zijn. Het vetweefsel (AT) speelt een centrale rol in de regulering van de stofwisseling. AT is de grootste endocrien orgaan dat van invloed dyslipidemie, atherosclerose, hyperinsulinemie en hyperglycemie 3. Evalueren AT homeostase en moleculaire mechanisms reguleren het zou een beter begrip van de metabole aandoeningen mogelijk te maken. Daarom is het ontrafelen van de mechanismen tot regeling van adipocytdifferentiatie, adipocyten grootte en vet pad massa zou helpen om nieuwe therapeutische behandeling voor obesitas stoornissen te ontwikkelen. Gebruik in vivo en in vitro methoden, is het mogelijk om de rol van voeding en genexpressie effecten op differentiatie van adipocyten en activiteit te bepalen. Om de AT homeostase bepalen de afweging tussen adipocyte differentiatie, proliferatie en apoptose zoals door ons protocol is even belangrijk als het analyseren van glucose en insuline metabole respons 22-24.
Expressieprofiel analyse van genen betrokken bij adipogenese, lipogenese, lipolyse, vetzuur opname, hypoxie, apoptose en proliferatie in primaire adipocyten en viscerale AT is een hoge doorvoer werkwijze voor het verkrijgen van een overzicht van adipocyt homeostase en de mogelijke dysfunctie.Interessante kandidaten kunnen verder worden geanalyseerd op eiwitniveau door Western blot of immunohistologische kleuring. Optimale resultaten door real-time PCR systeem aanvragen met symmetrische cyaninekleurstoffen moeten de concentraties van cDNA variërend van 1 tot 10 ng en de optimale primer concentraties van 50 tot 900 nm worden getest om specifieke amplificatie te minimaliseren. De kritische componenten zijn de primers; Voor elke serie hebben de smeltcurven strikt worden gecontroleerd om de specificiteit te waarborgen en om de vorming van primer dimeren te sluiten. Daarom worden bij een negatieve controle met H2O plaats van cDNA wordt aanbevolen. Verder worden in de handel verkrijgbare niet-symmetrische cyaninekleurstoffen verschaft als mastermengsels dat een passieve referentie kleurstof bevatten (zoals ROX) een interne referentie signaal. De cDNA signaal wordt genormaliseerd tijdens de data-analyse van de ROX signalen naar well-to-well signaal schommelingen te corrigeren. Een ander punt dat moet worden overwogen om een goo vestigend qPCR systeem is de keuze van het huishoud-gen. Voor elke voorwaarde, worden meerdere housekeeping genen gebruikt, bijvoorbeeld HPRT, β-actine, GAPDH, β-2-MG of HSP90.
HIF eiwitten gestabiliseerd door hypoxische condities meester regulatoren bepalen niet alleen adipocyten overleving, maar ook metabole veranderingen, zoals glucose, insuline tolerantie en vetmetabolisme 11,25,26. Om hypoxische gebieden vast te stellen in het vet pad, wordt HIF-1α bepaald AT secties door immunohistochemie. Omdat HIF eiwitten snel binnen 5 tot 10 minuten onder normoxische omstandigheden worden afgebroken, moet de procedure en de vastlegging van het vet pad voor de histologische analyse strak worden gecontroleerd om wachttijd te voorkomen. Daarom, om hypoxie zorgen niet alleen door HIF kleuring wordt pimonidazole gebruikt om hypoxische gebieden in de AT bepalen. Pimonidazole kan gedistribueerd naar weefsels, zoals reeds in de botten 27 kreegEn effectief markeer hypoxische gebieden door binding aan thiol bevattende eiwitten specifiek in hypoxische cellen, die verder in histologische secties wordt gedetecteerd door specifieke antilichaambinding 28. Maar ook andere markers en methoden worden toegepast om de hypoxie pad analyseren. Bijvoorbeeld, de betrokkenheid van de prolyl hydroxylase (PHD) enzym dat hydroxylatie van proline residuen onder normoxie induceren, alsook het Von Hippel-Lindau (VHL) eiwit, dat gehydroxyleerd prolinen herkennen en induceren de poly-ubiquitinering om proteasomale HIF bemiddelen degradatie, moeten worden geanalyseerd voor een volledig overzicht van de route 29,30. Bovendien zou overal detectie van HIFs ook de eiwitstabiliteit en afbraak welke veranderen 31,32 bepalen.
Bovendien proliferatie door Ki67 en apoptose door de TUNEL kleuring worden bepaald in vivo door middel van kleuring van AT histologische secties. Kwantificering van proliferatie door Ki67 enpoptosis door TUNEL of annexine V-kleuring door middel van flowcytometrie-analyse wordt ook uitgevoerd 33. Proliferatie kan uiteraard worden gemeten met andere technieken, zoals analyses van de celcyclus adipocyten, die niet bij de meting van Ki67-positieve cellen is gericht. Bovendien kan apoptose studie van TUNEL worden ingevuld door FACS analyses van annexine V en TOP-PR-3, die het niveau van necrose versus de apoptosis celdood proces zal bepalen. Apoptose is een fundamenteel proces voor het programma van celdood, die belangrijk is voor AT homeostase. Inderdaad, ontregeling van apoptosis adipocyten is eerder betrokken bij processen die bijdragen tot zwaarlijvigheid en lipodystrofie 34. Bovendien, in 2011, Keuper et al. Verbonden vetweefsel ontsteking adipocyten apoptose. Zij toonden aan dat macrofagen geïnduceerde apoptose in preadipocyten en adipocyten, waardoor macrofagen trekken. De werving van macrofagen versnelt ontsteking, die contributes om metabool syndroom, zoals glucose en insuline tolerantie 35. Echter, adipocyten apoptose is nog steeds een slecht bestudeerde fenomeen, ondanks de hypothese dat geïnduceerde apoptose adipocyten zou kunnen leiden tot een verminderde gewicht.
Het huidige protocol maakt gebruik van immunohistochemische benaderingen voor verschillende fenomeen te bestuderen, zoals proliferatie, apoptose en hypoxie in vivo. Daarom werd het weefsel gefixeerd met 4% formaldehyde, wat een kritische stap. Een uitgebreide weefsel fixatie tijd leidt tot verandering van de epitopen, die niet toegankelijk zijn voor het antilichaam worden. Daarentegen korte fixatietijd verhoogt de gevoeligheid van epitopen reagentia. De aanbevolen optimale tijd van fixatie is 24 uur. Bovendien is de dikte van de secties beïnvloedt ook de antilichamen binden aan hun epitopen; optimale dikte tussen 2 en 5 urn. Secties dikker dan 5 micrometer zal vals-positieve resultaten als gevolg van verhoogde binding sites. Daarentegen isitingen dunner dan 2 micrometer bevatten minder binding sites en positieve gebieden zijn niet goed gedefinieerd. Zijn kritische factoren zijn het antilichaam zelf, incubatietijd, concentratie en gelijkmatige temperatuur, waarbij de kwaliteit van de specifieke binding aan de epitopen te beïnvloeden. Daarom valideren antilichaam concentratie en incubatietijd nodig voor elke conditie.
Om het onderzoek te voltooien, geven we een in vitro adipocytdifferentiatie protocol, die kan worden verlengd met verschillende behandelingen, stimulatie of co-culturen. Gebruikmakend van in vitro kweken van adipocyten, is het mogelijk om defecten in adipocytdifferentiatie en functies bepalen. Om betrouwbare resultaten te verkrijgen, als voor alle primaire cellen, het gezond gedrag en het uiterlijk van de ADSCs en adipocyten is heel belangrijk. De granulariteit, cytoplasmatische vacuolations en / of loslaten zijn tekenen van achteruitgang, wijst op een onvoldoende medium, microbiële besmetting of veroudering van de primairecellen. Dit protocol wordt gebruikt geïsoleerde adipocyten van het vetkussentje weefsel, terwijl het ook mogelijk om mesenchymale stamcellen geïsoleerd uit beenmerg zoals beschreven door 36 andere protocollen gebruiken. De laatste omvat stromale voorlopercellen cellen, die extra differentiatie problemen die zich voordoen bij de zeer vroege stap van adipocytdifferentiatie afbreuk zouden kunnen doen, kan dit worden gemist in onze huidige protocol. Bovendien kan snel ADSCs (meer dan 10 keer binnen één week) uitgebreid en langdurig gekweekte ADSCs na passages steeds hun pluripotentie mesenchymale 37,38 behouden. Een ander voordeel van het gebruik ADSCs is dat men gemakkelijk kan overschakelen naar menselijke, aangezien ADSCs van patiënten door liposuctie die een eenvoudige en minimaal invasieve wijze kunnen worden geoogst.
Zoals AT beïnvloedt verschillende andere organen in een endocriene wijze, moet het protocol worden uitgebreid tot adipokines. Adipokines, zoals leptine, adiponectine, tumornecrosefactor-α (TNF) and resistine, afgescheiden door adipocyten is bekend dat metabole ziekten beïnvloeden door het regelen van de vetstofwisseling, energie homeostase en insulinegevoeligheid 39. Daarom moet serum en adipocyten secretoom analyses worden uitgevoerd. Bij AT dysfunctie, adipokines en pro-inflammatoire cytokines, zoals IL-6, kan leiden tot ontregeling van organen zoals de lever en de pancreas, en spierfunctie 4. Om systemische orgaanfalen uitgesloten, terwijl diermodellen of celculturen worden getest op hun reactie op stimulatie en glucose opname.
Hier hebben we een protocol voor de analyse de basistoestand van AT en adipocyten in vivo en in vitro moleculaire mechanismen van adipocyten homeostase en functionaliteit onthullen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag vriendelijk bedanken Dr. J. Luther en K. Ubieta voor het bereiden van de gegevens en Dr. B. Grötsch voor proeflezen het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (BO3811 / 1-1-Emmy Noether).
Materials
| RNAlater solution | Ambion | AM7021 | RNA stabilization solution |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368813 | |
| SYBR Select Master Mix | 4472908 | ||
| Purified Mouse Anti-Human Ki-67 | BD Biosciences | 550609 | Clone B56 (RUO) |
| Purified Mouse Anti-Human Ki-67 Clone B56 (RUO) | 550609 | Proliferation marker | |
| FITC Annexin V | BioLegend | 640906 | |
| Cleaved Caspase-3 Rabbit mAb | Cell signalling | 9664S | Clone 5A1E |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | 9664 | Apoptosis marker | |
| Hypoxyprobe-1 Plus Kit | Hypoxyprobe | HP2-200Kit | Hypoxia marker, Solid pimonidazole HCl (Hypoxyprobe-1), FITC conjugated to mouse IgG₁ monoclonal antibody (FITC-MAb1), Rabbit anti-FITC conjugated with horseradish peroxidase |
| Lipofectamine2000 Reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
| TO-PRO-3 Iodide | T3605 | Nuclear counterstain, Monomeric cyanine nucleic acid stain, Excitation⁄Emission: 642⁄661 nm | |
| Mayer’s hemalum | Merck | 109249 | hematoxylin |
| pegGOLD TriFast | Peqlab | 30-2030 | TRIzol, single-phase solution of guanidinisothiocyanat and phenol |
| Percellys Ceramic Kit 1.4 mm | 91-PCS-CK14 | tubes containing ceramic beads (1.4 mm) | |
| Precellys 24 | 91-PCS24 | homogenizer | |
| HIF-1 alpha Antibody | Pierce | PA1-16601 | |
| HIF-1 alpha Antibody, 16H4L13 | 700505 | Hypoxia marker | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein | Roche | 11 684 795 001 | TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) |
| Eosin | Sigma | 318906 | |
| DNase I Solution (1 unit/µL) | Thermo Scientific | EN0525 | |
| biotinylated anti mouse IgG (H+L) | Vector Laboratories | BA-9200 | |
| biotinylated anti mouse IgG (H+L) | BA-1000 | ||
| Vectastain ABC Kit | PK-4000 | ||
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | H-1200 |
References
- Gong, Z., Muzumdar, R. H. Pancreatic function, type 2 diabetes, and metabolism in aging. Int J Endocrinol. , 320482 (2012).
- Deng, Y., Scherer, P. E. Adipokines as novel biomarkers and regulators of the metabolic syndrome. Ann N Y Acad Sci. 1212, 1-19 (2010).
- Rezaee, F., Dashty, M. Role of Adipose Tissue in Metabolic System Disorders Adipose Tissue is the Initiator of Metabolic Diseases. J Diabetes Metab. , 008 (2013).
- Rutkowski, J. M., Stern, J. H., Scherer, P. E. The cell biology of fat expansion. J Cell Biol. 208, 501-512 (2015).
- Ma, X., Lee, P., Chisholm, D. J., James, D. E. Control of adipocyte differentiation in different fat depots; implications for pathophysiology or therapy. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 1 (2015).
- Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metab. 4, 263-273 (2006).
- Luther, J., et al. Elevated Fra-1 expression causes severe lipodystrophy. J Cell Sci. 124, 1465-1476 (2011).
- Luther, J., et al. Fra-2/AP-1 controls adipocyte differentiation and survival by regulating PPARgamma and hypoxia. Cell Death Differ. , (2014).
- Semenza, G. L. Regulation of mammalian O2 homeostasis by hypoxia-inducible factor 1. Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 551-578 (1999).
- Kim, W., Kaelin, W. G. The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein: new insights into oxygen sensing and cancer. Curr Opin Genet Dev. 13, 55-60 (2003).
- Aragones, J., Fraisl, P., Baes, M., Carmeliet, P. Oxygen sensors at the crossroad of metabolism. Cell Metab. 9, 11-22 (2009).
- Sun, K., Halberg, N., Khan, M., Magalang, U. J., Scherer, P. E. Selective inhibition of hypoxia-inducible factor 1alpha ameliorates adipose tissue dysfunction. Mol Cell Biol. 33, 904-917 (2013).
- Imai, T., Jiang, M., Chambon, P., Metzger, D. Impaired adipogenesis and lipolysis in the mouse upon selective ablation of the retinoid X receptor alpha mediated by a tamoxifen-inducible chimeric Cre recombinase (Cre-ERT2) in adipocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 224-228 (2001).
- Clegg, D. J., Brown, L. M., Woods, S. C., Benoit, S. C. Gonadal hormones determine sensitivity to central leptin and insulin. Diabetes. 55, 978-987 (2006).
- Haluzik, M., et al. Genetic background (C57BL/6J versus FVB/N) strongly influences the severity of diabetes and insulin resistance in ob/ob mice. Endocrinology. 145, 3258-3264 (2004).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical biochemistry. 162, 156-159 (1987).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Planat-Benard, V., et al. Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological and therapeutic perspectives. Circulation. 109, 656-663 (2004).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-driven alterations in adipocyte mitochondrial activity reveal a crucial adaptive process that preserves insulin sensitivity in obesity. Nat Med. 18, 1539-1549 (2012).
- Trajcevski, K. E., et al. Enhanced lipid oxidation and maintenance of muscle insulin sensitivity despite glucose intolerance in a diet-induced obesity mouse model. PLoS One. 8, 71747 (2013).
- Montgomery, M. K., et al. Mouse strain-dependent variation in obesity and glucose homeostasis in response to high-fat feeding. Diabetologia. 56, 1129-1139 (2013).
- de Queiroz, K. B., et al. Molecular mechanism driving retroperitoneal adipocyte hypertrophy and hyperplasia in response to a high-sugar diet. Mol Nutr Food Res. 58, 2331-2341 (2014).
- Ye, J. Emerging role of adipose tissue hypoxia in obesity and insulin resistance. Int J Obes (Lond). 33, 54-66 (2009).
- Xiong, Y., et al. The local corticotropin-releasing hormone receptor 2 signalling pathway partly mediates hypoxia-induced increases in lipolysis via the cAMP-protein kinase A signalling pathway in white adipose tissue. Mol Cell Endocrinol. 392, 106-114 (2014).
- Bozec, A., et al. Osteoclast size is controlled by Fra-2 through LIF/LIF-receptor signalling and hypoxia. Nature. 454, 221-225 (2008).
- Varia, M. A., et al. Pimonidazole: a novel hypoxia marker for complementary study of tumor hypoxia and cell proliferation in cervical carcinoma. Gynecol Oncol. 71, 270-277 (1998).
- Park, M. H., Choi, K. Y., Jung, Y., Min do, S. Phospholipase D1 protein coordinates dynamic assembly of HIF-1alpha-PHD-VHL to regulate HIF-1alpha stability. Oncotarget. 5, 11857-11872 (2014).
- Tennant, D. A., et al. Reactivating HIF prolyl hydroxylases under hypoxia results in metabolic catastrophe and cell death. Oncogene. 28, 4009-4021 (2009).
- Kim, J., So, D., Shin, H. W., Chun, Y. S., Park, J. W. HIF-1alpha Upregulation due to Depletion of the Free Ubiquitin Pool. Journal of Korean medical science. 30, 1388-1395 (2015).
- Amelio, I., et al. TAp73 opposes tumor angiogenesis by promoting hypoxia-inducible factor 1alpha degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 226-231 (2015).
- Suga, H., et al. Adipose tissue remodeling under ischemia: death of adipocytes and activation of stem/progenitor cells. Plast Reconstr Surg. 126, 1911-1923 (2010).
- Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders. J Diabetes Res. 2015, 970375 (2015).
- Keuper, M., et al. An inflammatory micro-environment promotes human adipocyte apoptosis. Mol Cell Endocrinol. 339, 105-113 (2011).
- Sera, Y., et al. Hematopoietic stem cell origin of adipocytes. Experimental hematology. 37, 1108-1120 (2009).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue engineering. 7, 211-228 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 13, 4279-4295 (2002).
- Scherer, P. E. Adipose tissue: from lipid storage compartment to endocrine organ. Diabetes. 55, 1537-1545 (2006).
