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Immunology and Infection

Los ensayos cualitativos y cuantitativos para la detección y caracterización de proteínas de antimicrobianos

Published: April 10, 2016
doi:
10.3791/53819
, ,
1Department of Advanced Technology,The MITRE Corporation, 2Center for Biomedical Engineering,Brown University, 3The MITRE Corporation

Summary

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Abstract

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Introduction

Antimicrobial agents play an essential role in targeting a wide range of microorganisms such as viruses, fungi, and bacteria. The antimicrobial activities produced by various bacteria range in target specificity from broad-spectrum to species-specific, including clinically relevant bacterial pathogens 1. In nature, protein antimicrobial compounds like bacteriocins and lysins represent a microbial arsenal of tools for self-defense, replication, and nutrient acquisition 2,3. Serving as mediators of population dynamics within microbial communities, protein antimicrobials provide a competitive advantage to the producing organism over nonproducing, sensitive species 4. As recombinant enzymes and probiotics, these proteins also have an economic and societal importance as the need for new sources of pathogen control increases with each new expansion of antimicrobial resistance within the bacterial population 5.

The first evaluations of newly discovered protein antimicrobials include determining the basic physical characteristics that are inherent to the enzyme. Methods for rapid screening of potential antimicrobials allow selection of candidates with hydrolytic activities against the desired target substrates. The microslide diffusion assay and the quantitative dye-release assay allow for the use of a variety of substrates in the detection of enzymatic hydrolysis. For protein antimicrobial enzymes with activity against the bacterial cell wall, the versatility of these assays allow rapid and effective, qualitative and quantitative screening against viable bacterial cells (microslide assay only), heat-killed whole bacterial cell substrates, or purified peptidoglycan from the target bacterium. These assays have utility in antimicrobial enzyme discovery for use in fields such as alternative therapeutics, food supplements, and inhibitors of biofilm production.

The microslide diffusion assay and the dye-release assay are demonstrated methods for detection and characterization of novel protein antimicrobials. The microslide diffusion assay provides a relative (qualitative) estimate of antimicrobial activity and allows for minimal inference of enzyme concentration and activity. Using this method, activity is readily visualized as the development of a zone of lysis with the absence of activity resulting in a lack of zone formation. The rate of zone development and the zone diameter are indicative of the amount and purity of the enzyme present in the sample; however, this rate and the quality of the substrate clearing within the zone can also be affected by the presence of contaminants, the completeness of the hydrolysis reaction, and the type of substrate. Interfering contaminants can affect the rate of enzyme diffusion from the well, while incomplete hydrolysis or variation of the substrate type can result in a turbid zone of lysis 6.

The dye-release assay quantitatively assesses the amount of covalently-linked Remazol brilliant blue R dye products released into the reaction supernatant from the enzymatically hydrolyzed substrate. The method has only slight variability associated with a difference in substrate, thus allowing greater sensitivity for detection of hydrolysis as compared to the microslide diffusion assay. These properties allow the method to have utility in the characterization of biochemical properties of the enzyme and in the standardization of the assay for comparison between different antimicrobial enzymes.

In this protocol, we provide methods to perform the basic microslide diffusion assay and dye-release assay, while demonstrating the scale of detection limits and variability for each. The assays are used to perform basic evaluations of an unknown protein antimicrobial purified from the culture supernatant of an uncharacterized soil bacterial isolate. Observed activities against bacterial cell substrates within the assays allow comparison of reaction activities between a previously uncharacterized protein antimicrobial and α-chymotrypsin, a control proteolytic enzymes. These protocols provide a foundation for the application of the two techniques that can be expanded and modified to accommodate varied applications.

Protocol

1. Preparación de bacterias y peptidoglicano Sustratos Nota: Los sustratos de células enteras bacterianas y peptidoglicanos purificados se utilizan como sustratos de enzimas, tanto en el ensayo de difusión y MicroSlide el ensayo de liberación de colorante. Estos sustratos requieren preparación antes de la realización de las reacciones enzimáticas. El siguiente protocolo describe su preparación. Todo el sustrato celular bacteriana Producir sustrato celular bacteriana inoculando 500 ml de caldo nutriente con un cultivo durante la noche de 2 ml de Bacillus subtilis 168 (American Type Culture Collection; ATCC 23857). Incubar a 30 ° C con agitación (125 rpm) hasta que el cultivo alcanza una fase exponencial de crecimiento, definida como una fase de crecimiento rápido dando como resultado la duplicación del cultivo bacteriano. Para el cultivo de Salmonella enterica subsp. Enterica (ATCC 10708), utilice caldo nutriente como un medio de crecimiento a 37 ° C con agitación (125 rpm). </li> Heat-mata cada cultura en autoclave durante 10 minutos a 121 ° C bajo 3 atm de presión. Se recoge el sustrato de bacterias muertas por calor por centrifugación durante 20 min a 5.000 x g. Lavar el sedimento tres veces con 1 Tipo de agua y volver a suspender en una cantidad mínima de agua. En este estudio, suspender los sustratos de 1.200 l. Alícuota de 300 l de los sustratos de células bacterianas a 1,5 ml tubos de microcentrífuga y almacenarlos a 20 ° C. Sustrato El peptidoglicano purificado Purificar peptidoglicano de la bacteria del sustrato diana 7-10 o adquirir de un proveedor (véase Materiales y equipos de mesa). Purificar preparaciones peptidoglicano crudo a partir de polímeros de la pared celular de accesorios. 2. cualitativa MicroSlide Difusión de ensayo [Modificado de Lachica, et al. 11] Nota: El ensayo de difusión es MicroSlideun método cualitativo para la detección de la presencia de la enzima antimicrobiana en una muestra. Como la enzima difunde a través de un sustrato de matriz que contiene agarosa, una zona de compensación se desarrolla como la enzima hidroliza el sustrato. El siguiente protocolo describe la preparación y el rendimiento del ensayo de difusión MicroSlide para detectar cualitativamente la presencia de antimicrobianos de proteínas. Determinar la concentración de la enzima antimicrobiana que ser evaluado usando un equipo del ácido bicinconínico (BCA) de ensayo de proteínas de acuerdo con el protocolo del fabricante. Utilizar solución salina tamponada con fosfato (PBS) como un tampón de enzima; sin embargo, determinar empíricamente el adecuado tampón para la enzima dado. Realizar una dilución en serie de la enzima antimicrobiana utilizando solución salina tamponada con fosfato (PBS) como tampón de reacción. La dilución en serie usada en estos ensayos de difusión MicroSlide produce masas de proteínas de ensayo final de 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 mg, y 10 g por volumen de reacción. Prescindir de masas de proteínas en tubos de microcentrífuga individuales y ajustar los volúmenes de proteína de 20 l usando PBS en preparación para su adición a MicroSlide pocillos de reacción. Hacer una solución de agarosa al 0,5% mediante la disolución de 0,25 g de agarosa en 50 ml de PBS. Calentar la solución a ebullición hasta que la agarosa se disuelva completamente. Determinar el agua perdida durante el proceso de fusión en peso y volver a agregar a la solución. Añadir 50 l de azida de sodio 10% en agua a la solución de agarosa y ajustar la temperatura de la solución a 50 ° C en un baño de agua. Se añade la azida de sodio para inhibir el crecimiento bacteriano contaminante durante la incubación del ensayo de difusión MicroSlide. Si se utilizan células viables como sustrato, omitir la azida de sodio de la solución de agarosa. Descongelar el sustrato de bacterias muertas por calor en el hielo. Vuelva a suspender el sustrato bacteriana en 12 ml de la solución de agarosa a aproximadamente coincide con la turbidez de una McF 2,0arland equivalencia estándar (ver Tabla de Materiales). Compara las turbiedades de las soluciones mediante la visualización de una línea de color negro sobre un fondo blanco a través de las soluciones, la adición de sustrato de las bacterias a la agarosa hasta que se consigue la turbidez aproximada. Inmediatamente pipeta 3 ml de la solución de agarosa-sustrato a cada MicroSlide (25 x 75 x 1 mm 3). Después de las diapositivas se solidifican, perforar tres pozos en la capa de agarosa-sustrato de cada MicroSlide usando un perforador de corcho (4,8 mm de diámetro). Añadir 20 l de cada dilución en serie de proteínas ajustado a sus respectivos pozos. Utilice PBS (20 l) o albúmina de suero bovino (5 g en 20 l de PBS) en un pocillo de control negativo. Use enzimas bacteriolíticas conocidos apropiados para el sustrato, tales como la lisozima, como control positivo. Incubar el portaobjetos en una cámara de humedad a 37 ° C o la temperatura de actividad óptima de la enzima. La duración de la incubación depende de la concentración yla actividad específica de la enzima antimicrobiana. Un tiempo de reacción típico es durante la noche (aproximadamente 16 horas). Después de la incubación, observar las imágenes se desliza debajo de la luz y de captura indirectos de desarrollar el ensayo utilizando una cámara reflex de lente única digital con una lente de 60 mm a una distancia focal de aproximadamente 30 cm. Nota: La actividad enzimática de la proteína antimicrobiana para el sustrato dado se correlaciona con el desarrollo de una zona clara de la hidrólisis, que se forma alrededor del así como la enzima se difunde en la agarosa. Para calificar la actividad enzimática, observar los tamaños de las zonas que se forman alrededor de cada pocillo. Alta actividad enzimática se refiere cualitativamente a una zona más grande, mientras que la baja actividad enzimática se refiere cualitativamente a una zona más pequeña. 3. Sustrato Etiquetado – Remazol Brilliant Blue R tinte de etiquetado [Modificado de Zhou 12] Nota: En el ensayo de liberación de tinte, el sustrato es covalente Linked para Remazol brillante tinte R azul. El siguiente protocolo describe la preparación de sustratos de enzimas teñidos. Hacer una solución de hidróxido de sodio 250 mM (NaOH) por disolución de 1 g de NaOH en 99 ml de agua de tipo I que se utilizarán para la fabricación de una solución 200 mM Remazol Brilliant Blue R colorante (RBB). Hacer una solución RBB 200 mM disolviendo 1,25 g RBB en 98,75 ml ± 1 ml de una solución de NaOH mM fresco 250 (paso 3.1). Vuelva a suspender las células bacterianas muertas por calor a una concentración de 0,5 g de peso húmedo en 30 ml de solución de RBB. Para peptidoglicano purificado, una nueva suspensión del peptidoglicano en una concentración de 0,3 g de peso húmedo en 30 ml de solución de RBB. Incubar la mezcla de reacción en un matraz Erlenmeyer sobre una plataforma giratoria durante 6 horas a 37 ° C con agitación suave. Transferir la mezcla de reacción a un 4 ° C incubadora, y se incuba durante una 12 h adicionales con mezcla suave. Después de la incubación, recoger el sustrato teñido por centrifugación a 3000 xgpor 30 min. Decantar la solución de tinte a partir del sedimento sustrato. Eliminar tinte soluble no covalente de los sustratos por lavado de las células marcados con colorante o peptidoglicano repetidamente (aproximadamente 3-5 lavados) con agua de tipo I, seguido de centrifugación. Con cada adición de agua, vuelva a suspender el sedimento de fondo. Nota: Cuando Sin colorante, soluble ya no es visible en el agua de lavado después de la centrifugación. El sustrato debe dar un lavado adicional. Tenga en cuenta que el sustrato se mantendrá azul, mientras que el sobrenadante del último lavado será clara. Almacenar los sustratos teñidos en suspensión en una cantidad mínima de agua a -20 ° C para su uso posterior. 4. cuantitativa del tinte de liberación Ensayo Nota: Durante el ensayo de liberación de tinte, la hidrólisis del sustrato teñido-RBB en los comunicados de reacción enzimática productos teñidos en el sobrenadante de reacción. medida colorimétrica de la cantidad de colorante liberado indica el amount de la actividad enzimática presente dentro de la muestra para una enzima dada. El método cuantitativo permite la comparación de diferentes enzimas a través de los sustratos y permite la variación de las condiciones ambientales que influyen en la reacción enzimática (por ejemplo, temperatura, salinidad y pH). El siguiente protocolo describe la preparación y el rendimiento del ensayo de liberación de colorante para detectar cuantitativamente la actividad enzimática de los antimicrobianos de proteínas. Preparación para el ensayo de liberación de tinte Permitir que el sustrato teñido congelado para volver a temperatura ambiente y lavar dos veces con tampón de ensayo (PBS), que se determina empíricamente para la enzima dado. Calcular el volumen de suspensión de sustrato que se necesita multiplicando el volumen de reacción de 200 l por el número de ensayos de liberación de colorante a realizar. Preparar la suspensión de sustrato mediante la adición de sustrato teñido con el volumen de tampón de ensayo, determinado en el punto 4.1.2, hasta una densidad óptica (DO) de 2,0 se consigue a 595 nm utilizando un espectrofotómetro. Para permanecer dentro de las limitaciones funcionales del espectrofotómetro, medir la OD 595 2.0 como 1.0 para una dilución 1: 1 de la solución concentrada. Utilizar tampón de ensayo como un blanco. Nota: La turbidez sustrato para la reacción se puede elevar más allá de 2,0 para que coincida con los niveles de actividad de enzimas altamente eficientes. Suspender el antimicrobiano proteína para ser evaluado en tampón de ensayo a una concentración estimada de 1 mg / ml. Usando el ensayo de microplaca de un Kit de ensayo de proteínas BCA según el protocolo del fabricante, determinar la concentración real de la muestra de proteína a ensayar. Ajustar la concentración de la suspensión de acciones a 1 mg / ml usando tampón de ensayo. Usando el ensayo de liberación de tinte para determinar las óptimas condiciones de incubación para una proteína antimicrobiana Diluir la suspensión antimicrobiana de stock de proteínas a 100 ng / l. Esta concentración da afmasa de reacción inal de 1 g de proteína por volumen (10 l) añadido a la reacción de ensayo. Determinar el rango térmico que deben evaluarse para la proteína bacteriolítica. La amplitud térmica en estos ensayos incluyó 5 ° C, 15 ° C, 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C, 55 ° C y 65 ° C. Realizar los ensayos de reacción en 0,5 ml tubos de microcentrífuga. Para cada condición térmica, añadir 10 l de la proteína de valores para 200 l de suspensión de sustrato preparado. Incubar en un ciclador térmico durante 8 horas con mezclado por inversión una vez por hora. Después de la incubación, detener las reacciones mediante la adición de 25 l de etanol. Eliminar sin digerir, el sustrato insoluble por centrifugación a 3000 xg durante 2 min, y la transferencia de 150 l del sobrenadante de reacción para cada mezcla de reacción a una microplaca de 96 pocillos de fondo plano, teniendo cuidado de no perturbar el pellet de sustrato sin digerir. Medir la actividad enzimática de la proteína AntimicrobIal para el sustrato dado mediante la determinación de la cantidad de colorante soluble RBB disociado del sustrato después de la hidrólisis enzimática. Para cuantificar la actividad enzimática, se mide la absorbancia del sobrenadante a 595 nm utilizando un espectrofotómetro de microplacas. El aumento de la absorbancia por el tinte soluble liberada en el sobrenadante del sustrato marcado es una medida cuantitativa de la actividad enzimática. Nota: El cambio en la absorbancia está representado por unidades de actividad (UA), donde 1 UA resultado en un aumento de 0,01 en la densidad óptica del sobrenadante reacción de liberación de colorante en 595 nm. Una reacción en blanco, se incubaron con todos los componentes de la reacción excepto la enzima, se utiliza para restar cualquier colorante que libera del sustrato marcado con RBB debido a la incubación. La temperatura óptima enzimática proporciona la unidad de medida máxima actividad. Repetir los pasos a través de 4.2.1 4.2.7 usando diversos tampones de incubación, para determinar las condiciones de tampón óptimos para la enzima antimicrobiana. en tstos ensayos, utilizan PBS. Usando el ensayo de liberación de tinte para determinar la concentración mínima del activo a la temperatura óptima de incubación para una proteína antimicrobiana Realizar una dilución en serie de las acciones suspensión de proteína antimicrobiana usando tampón de ensayo. La gama de la serie de dilución variará con la actividad de la enzima antimicrobiana. La dilución en serie se utiliza en estos ensayos produjo cantidades de proteína de ensayo final de 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 mg, y 10 mg. Realizar cada ensayo de reacción en una microplaca de 48 pocillos de fondo plano. Para cada condición de ensayo, añadir 10 l de la respectiva suspensión de proteína a 200 l de suspensión de sustrato preparada. Ajuste cualquier variación en el volumen de la solución de proteína añadida a la reacción a 10 l usando tampón de reacción. Sellar la microplaca con placa de lámina de sellado para evitar la variación de volumen debido a la evaporación. Incubar en un incubador agitador a la óptima determinada entemperatura de incubación para la proteína dada antimicrobiana durante 16 horas con agitación. Después de la incubación, detener la reacción mediante la adición de 25 l de etanol a cada pocillo y quitar sustrato sin digerir por centrifugación a 3000 xg durante 2 min. Transferir 150 l del sobrenadante de reacción para cada mezcla de reacción a una microplaca de 96 pocillos de fondo plano, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento del sustrato sin digerir. Para cuantificar la actividad enzimática, se mide la absorbancia del sobrenadante a 595 nm utilizando un espectrofotómetro de microplacas. Una reacción en blanco, se incubaron con todos los componentes de la reacción excepto la enzima, se utiliza para restar cualquier colorante que libera del sustrato marcado con RBB debido a la incubación. El aumento de la absorbancia por el tinte soluble liberada en el sobrenadante del sustrato marcado proporciona una medida cuantitativa de la actividad enzimática. Nota: El cambio en la absorbancia está representado por unidades de actividad (UA), donde 1 UA en resultadosun aumento de 0,01 en la densidad óptica del sobrenadante reacción de liberación de colorante en 595 nm.

Representative Results

El ensayo de difusión MicroSlide y el ensayo de liberación de colorante cuantitativa son métodos eficaces para la detección y medición de las investigaciones iniciales de nuevos antimicrobianos proteínas. Cada ensayo tiene ventajas y limitaciones; sin embargo, cuando se realiza en conjunto, permiten la rápida detección inicial y la caracterización básica de un antimicrobiano. El ensayo de difusión MicroSlide permite de manera eficiente para la detección rápida de las bibliotecas microbianas, produciendo antimicrobianos de proteínas. Cuando los niveles de concentración de la enzima son motivo de preocupación, la sensibilidad de las limitaciones de detección puede limitar el ensayo, lo que requiere una mayor cantidad de enzima que se añade al pocillo de reacción que el ensayo de liberación de colorante. Como se ilustra en la Figura 1, las propiedades cualitativas del ensayo permiten que el observador de comparar cantidades de la enzima relativas presentes dentro de cada pocillo. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> En la zona de revelado de la lisis, se ilustra en la Figura 1A (25 g de enzima), el borde delantero de la zona de muestra de lisis turbia o incompleta del sustrato, mientras que la zona más cercana al pozo muestra un sustrato lisis más completo. Este fenómeno, un producto de la concentración cada vez menor de la enzima de difusión en el borde delantero, complica la medición exacta del diámetro de la zona. A medida que los pozos B (15 g), C (10 g), D (5 mg), E (1,0 g), y F (0,1 g) se observan en la Figura 1, el diámetro de la zona de la lisis completa se disipa a la extinción en correlación con la cantidad reducida de la enzima. Para la condición F (0,1 g), la concentración de la enzima dentro de la agarosa es inferior al límite que permita la enzima de difusión para ser visualizado cuando se mueve a través de la agarosa, hidrolizar el sustrato. El ensayo de difusión MicroSlide también se ha ejecutado utilizando purificadas de Bacillus subtilis Peptidoglycan como sustrato (Figura 2). Mientras que la zona está menos definido que los observados con células enteras Salmonella enterica debido a la reticencia de los peptidoglicanos de suspender de manera uniforme en la agarosa, la hidrólisis del peptidoglicano por la enzima antimicrobiana desconocido es aparente. El ensayo de liberación de tinte es un ensayo más sensible y versátil que el ensayo de difusión MicroSlide, lo que permite un límite de detección inferior y la variación de los factores ambientales que afectan a la reacción de la enzima. En los ensayos representativos, se varió la temperatura para determinar la temperatura óptima para la enzima antimicrobiana, determinó que 35 ° C en PBS (Figura 3). Este óptimo se ve claramente en los sobrenadantes de reacción como el aumento de cantidades de color azul (Figura 3B), así como se representa en unidades de actividad derivadas de las mediciones de absorbancia a 595 nm (Figura 3A). losversatilidad del ensayo de liberación de colorante permite al investigador varían no sólo las temperaturas, sino también el tampón de reacción y los componentes del tampón para determinar rápidamente las condiciones de incubación óptimos para una enzima dada. El nivel de actividad de la enzima desconocida antimicrobiano (Figura 4) y la enzima de control de α-quimotripsina (Figura 5) se midieron a la temperatura de incubación óptima determinada de 35 ° C en PBS contra sustrato muertos por calor Bacillus subtilis marcado con RBB. Comparación de los resultados de la Figura 4 y la Figura 5 indica que la enzima antimicrobiana desconocida tiene casi dos veces la afinidad por el B. sustrato subtilis. Además, el control de α-quimotripsina no digerir completamente la muerta por calor B. sustrato subtilis dentro del pozo (datos no mostrados). La actividad del control α-quimotripsina comienza a la placaau alrededor de 0,3 mg en comparación con el continuo aumento de unidades de actividad a través de todas las cantidades de enzimas para la enzima antimicrobiana desconocida (Figura 4 y Figura 5). Esto puede indicar que la enzima desconocida tiene una mayor actividad sostenida o que hay un mayor número de sitios de escisión disponible para la enzima dentro de la B. sustrato subtilis. Figura 1:. Enzima Actividad contra Salmonella enterica Whole sustrato celular El ensayo de difusión MicroSlide se utilizó para evaluar cualitativamente la actividad de una proteína desconocida antimicrobiana contra Salmonella enterica subsp enterica muertas por calor (ATCC 10708).. Las masas de proteínas de la antimicrobiano desconocida en suspensión en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que se añade a los pocillos respectivos delas diapositivas incluyen 25 mg (bien A), 15 g (bien B), 10 mg (bien C), 5 g (bien D), 1 g (bien E), y 0,1 g (bien F). PBS solo se utilizó para los controles negativos de los ensayos. Zonas de lisis fueron imágenes después de una incubación de 6 horas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2:. Actividad enzimática frente a Bacillus subtilis Cell Wall peptidoglicano El ensayo de difusión MicroSlide se utilizó para evaluar cualitativamente la actividad de una proteína desconocida antimicrobiana contra peptidoglicano de Bacillus subtilis 168. Suspendido en 20 l de PBS, 10 mg del agente antimicrobiano desconocido se añadió al pocillo A de los micro-portaobjetos. PBS solo se utilizó como un negativode control para el ensayo (bien B). La zona de la lisis fue fotografiada después de una incubación de 6 horas a 37 ° C. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3:. La temperatura de reacción óptima para una proteína antimicrobiana La versatilidad del ensayo de liberación de colorante permite la variación de los parámetros físicos y químicos, tales como temperaturas de incubación y tampones, para determinar sus influencias sobre la actividad de la enzima de interés 6. Como se ilustra en esta figura, se evaluó la actividad antimicrobiana de la proteína desconocida (1 g) en PBS contra marcadas con RBB muertas por calor de Bacillus subtilis bajo un rango de temperaturas de incubación. Se muestra como unidades de actividad (UA) en (A), la absorbancia de RBB-bound productos liberados en el sobrenadante después de la hidrólisis se midió a 595 nm usando un espectrofotómetro de microplacas. En cada condición de temperatura, las reacciones sin enzima añadida se usaron para restar los efectos de cualquier tinte liberado que resultó de la incubación a las diversas temperaturas. Los sobrenadantes de reacción correspondientes a cada temperatura de incubación se obtuvieron imágenes antes de la medición de la absorbancia (B). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4:. Rango de actividad para una proteína antimicrobiana El intervalo de actividad para el antimicrobiano proteína desconocida se midió como unidades de actividad después de incubaciones durante la noche para 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, y 1000 ng , tal como se mide por la prot BCAensayo ein (A). Para estas reacciones, el marcado con RBB B. nivel de sustrato subtilis se incrementó para dar una densidad óptica de 5,0 a 595 nm para asegurar que la reacción con la más alta cantidad de enzima (1,000 ng) no hidrolizan completamente todo el sustrato disponible dentro del período de incubación de reacción. Las reacciones de control sin enzima añadida se usaron para restar los efectos de cualquier tinte liberado causada por la incubación solo. Los sobrenadantes de reacción correspondientes a cada cantidad de enzima se obtuvieron imágenes antes de las mediciones de absorbancia (B). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5:. Rango de actividad de α-quimotripsina El intervalo de actividad de α-quimotripsina se midió como activunidades dad después de incubaciones durante la noche para 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, y 1000 ng de enzima (A). Para estas reacciones, el marcado con RBB B. nivel de sustrato subtilis se incrementó para dar una densidad óptica de 5,0 a 595 nm para asegurar que la reacción con la más alta cantidad de enzima (1,000 ng) no hidrolizan completamente todo el sustrato disponible dentro del período de incubación de reacción. Las reacciones de control sin enzima añadida se usaron para restar los efectos de cualquier tinte liberado causada por la incubación solo. Los sobrenadantes de reacción correspondientes a cada cantidad de enzima se obtuvieron imágenes antes de las mediciones de absorbancia (B). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El ensayo de difusión MicroSlide y el ensayo de liberación de colorante proporcionan ventajas para la detección y caracterización de proteínas antimicrobianos no identificados previamente. Estos métodos rápidos y sensibles permiten el cribado de alto rendimiento de bibliotecas de código del organismo para la identificación de enzimas de interés antes de invertir mayores recursos de investigación. Como se identifican enzimas diana de alto perfil, las variaciones de los ensayos de detección se pueden usar para detectar rápidamente la enzima o para determinar las características bioquímicas de la enzima. Por ejemplo, durante un esquema de purificación de proteínas de múltiples etapas, el ensayo de difusión MicroSlide puede detectar rápidamente fracciones que contienen la enzima de interés. Además, optima de reacción para la enzima se puede determinar mediante la alteración de los tampones de reacción y las temperaturas de incubación en el ensayo de liberación de colorante.

El rango de los medios de enzima requerida para la detección en el ensayo de difusión MicroSlide es una función de la enzima caracteristics. limitaciones de detección del ensayo generalmente requieren el uso de mayores cantidades de la enzima que el ensayo de liberación de colorante. En este estudio, la comparación de los límites de detección del ensayo de difusión MicroSlide (Figura 1) para el ensayo de liberación de colorante (Figura 4) ilustra que el ensayo de difusión MicroSlide es una técnica menos sensible que el ensayo de liberación de colorante. Cuando la concentración de la enzima no es una preocupación, el ensayo MicroSlide permite la rápida selección inicial de las bibliotecas para la producción de proteínas antimicrobianos contra sustratos diana con mano de obra y equipo demandas bajas. Aunque requiere más esfuerzo y equipo, el ensayo de liberación de colorante es más sensible y reproducible, produciendo resultados cuantitativos que permiten la comparación entre ensayos de liberación de colorante del mismo o de diferentes enzimas para un sustrato dado. Los dos métodos se llevan a cabo fácilmente en la mayoría de los laboratorios de microbiología sin necesidad de instrumentación altamente especializado. En el repreensayos tivos, la enzima de control, α-quimotripsina, se detectó en cantidades tan bajas como 100 ng (Figura 5) mediante el ensayo de liberación de colorante, mientras que la cantidad mínima detectada en el ensayo de difusión MicroSlide fue de 1 g (datos no mostrados).

Proporcionar utilidad como un ensayo de detección cualitativa de enzimas antimicrobianas, un número de variaciones de el ensayo de difusión se ha informado de 11,13. En la revisión de estos ensayos, el ensayo de difusión MicroSlide fue desarrollado para su relativamente alta sensibilidad como una pantalla inicial y por su facilidad de observancia de reacción. Modificado de la obra de Lachica et al. 11, en ​​la que se utilizaron las superposiciones de agarosa para detectar la producción de nucleasas por cepas de Staphylococcus aureus, el ensayo de difusión MicroSlide opera de manera similar al método de inmunodifusión radial 14 como la proteína se difunde desde el pozo en el de agarosa que contiene el sustrato. El immunodiffu radialSion método detiene la expansión de la zona de inmunoprecipitación cuando el sistema alcanza un complejo equilibrio entre la formación de antígeno de difusión y el anticuerpo dentro de la agarosa. Por el contrario, el sustrato de la ensayo de difusión MicroSlide se digiere inicialmente por la proteína antimicrobiana de difusión en una zona continua expansión de lisis que rodea el pozo. El diámetro creciente de la zona continúa hasta que la enzima pierde actividad o el sustrato se agote. La tasa de la producción de la zona de la lisis se acelera como la pureza, y por lo tanto la actividad específica, de la enzima o la concentración de la enzima añadida a los aumentos así.

Para evaluar cuantitativamente la actividad enzimática de proteínas antimicrobianos contra muertos por calor B. subtilis, se eligió el ensayo de liberación de colorante. ensayos colorimétricos utilizando Remazol brillante colorante azul R (RBB) de la etiqueta sustratos permiten la evaluación versátil y sensible de la proteína antimicrobiana activiTy. La hidrólisis enzimática de los resultados de sustrato marcado-RBB en la liberación de productos de color azul soluble que puede ser medido fácilmente por un espectrofotómetro a 595 nm. Varias variaciones del ensayo de liberación de colorante RBB, desarrollado para caracterizar otras enzimas antimicrobianas proteínas, muestran la flexibilidad de este ensayo para la aplicación con otros sustratos. Por ejemplo, en la determinación de los efectos de lisostafina actividad bacteriolítica, Zhou, et al., Informó de un ensayo de liberación de colorante utilizando células estafilocócicas teñidos-RBB y estafilocócica peptidoglicano como sustratos 12. En una modificación de la aplicación de este ensayo de liberación de colorante RBB, se propuso sustrato Micrococcus luteus marcado con RBB para su uso como un medio rápido y sensible para el diagnóstico y la pantalla para enfermedades como la infección bacteriana y la presencia de un carcinoma maligno, que puede ser correlacionada con los niveles de expresión de lisozima humana en el suero sanguíneo 15. Además, los sustratos celulares de las bacterias marcadas con RBB tienen unalso sido usada en un método zymogram para la detección de lisozima 16.

Demostramos el límite de detección de rebajado, conveniencia y reproducibilidad del ensayo de liberación de colorante, lo que permite la detección rápida de la biblioteca para la producción de enzima. Modificaciones del ensayo permiten ensayos bioquímicos cuantitativos aguas abajo de caracterización, incluyendo efectos de la temperatura, pH y salinidad, así como los efectos de otras enzimas proteolíticas en la actividad de las proteínas antimicrobianas 6. Además, el ensayo de liberación de colorante cuantitativo se puede usar para comparar las actividades de múltiples enzimas para un sustrato dado. El ensayo de liberación de colorante RBB ha informado de utilidad para enzimas con actividad frente a los polisacáridos, además de la caracterización y detección de agentes antimicrobianos de proteínas. Pettersson y Eriksson informaron un ensayo para detectar la actividad endoglycanase usando gránulos de polisacárido, teñidos-RBB amorfas de la celulosa, xilano, manano, y presentasen el 17. En una expansión de estos hallazgos, un método sensible para la detección de enzimas quitinasa producida por Bacillus thuringiensis Bt-107 fue desarrollado utilizando quitina coloidal marcado con RBB 18. A partir de estos y otros estudios, fuentes comercialmente disponibles de sustratos teñidos-RBB han surgido para su uso en la detección de la actividad glucolítica, incluyendo aquellos contra queratina, amilopectina, amilosa, glicógeno, laminarina, d-xilano, glucano Azo-cebada, y almidón.

En este estudio, se demuestra la utilidad del ensayo de liberación de colorante en un formato de microplaca, lo que reduce el volumen de sustrato marcado con RBB y enzima requerida para producir el resultado colorimétrico. Como se ilustra en la Figura 4 y la Figura 5, el ensayo de liberación de colorante microplaca ofrece un límite de detección más bajo que el ensayo de difusión MicroSlide para la detección de la actividad enzimática. Con respecto a la utilización rápida, la conservación de la mano de obra, y la facilidad de interpretación, el micrófonoensayo de difusión roslide ofrece utilidad en pantallas iniciales de alto rendimiento para la presencia de actividad antimicrobiana, así como la indicación de la presencia de la proteína antimicrobiana en el aislamiento y purificación de proteínas pasos aguas abajo. La combinación de estos dos ensayos se complementan entre sí en la selección inicial y caracterización último de nuevos antimicrobianos proteínas

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was funded by The MITRE Corporation through the MITRE Innovation Program (Project 25MSR621-CA). The authors would like to thank Mark Maybury, Ph.D., Richard Games, Ph.D., James Patton, Ellen Mac Garrigle, Ph.D., Carl Picconatto, Ph.D., and Caroline Gary for their support and review of this work.

Materials

48-well flat-bottom microplate with low evaporation lid Becton Dickinson 3078
96-well flat-bottom microplate (Costar 3595) Corning, Inc. 3595
agarose Fisher Scientific BP162-100
α-chymotrypsin MP Biomedicals 215227205
Bacillus subtilis 168 American Type Culture Collection 23857
C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad
cork borer Humboldt H-9661
lysozyme Sigma-Aldrich L6876-1G
McFarland equivalence standard (2.0) Fisher Scientific R20412
microslides Fisher Scientific 22-38-103
nutrient broth Fisher Scientific S25959B
peptidoglycan of Bacillus subtilis 168 Sigma-Aldrich 69554-10MG-F
phosphate-buffered saline (1×) Teknova P0200
Pierce BCA Protein Assay Kit Life Technologies 23227
Synergy HT microplate spectrophotometer BioTek Instruments, Inc.
Remazol brilliant blue R dye (RBB) Sigma-Aldrich R8001
Salmonella enterica subsp. enterica American Type Culture Collection 10708
sodium azide Fisher Scientific S227-100
sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S318-500
Titer Tops pre-cut adhesive polyethylene film Diversified Biotechnology T-TOPS-50
UltraPure distilled water Invitrogen 10977-015
Name Company Catalog Number Comments
Solution
agarose solution
50 ml PBS
0.25 g agarose		 Add 10% sodium azide to the molten PBS/agarose solution
nutrient broth medium
4 g nutrient broth
500 ml Type I water
250mM sodium hydroxide (NaOH) solution
1 g NaOH
99 ml Type I water
200mM Remazol brilliant blue R dye (RBB)
1.25 g RBB
98.75 ml 250 mM NaOH solution
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References

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Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials. J. Vis. Exp. (110), e53819, doi:10.3791/53819 (2016).
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