定性的および定量的検出のためのアッセイおよびタンパク質の抗菌薬のキャラクタリゼーション

細菌やペプチドグリカン基板の作製注：全細胞細菌の基質および精製ペプチドグリカンをマイクロスライド拡散アッセイおよび色素放出アッセイの両方で酵素基質として使用されます。これらの基質は、酵素反応を実施する前に準備を必要とします。以下のプロトコルは、それらの調製を説明しています。 全体の細菌の細胞基質 枯草菌 168 2mLの一晩培養物を栄養ブロスを500mlに接種することによって、細菌の細胞基質を産生する（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ATCC 23857）を。培養は細菌培養の倍増、その結果急速な成長期のように定義され、指数増殖期に達するまで（125 rpm）し振とうしながら30℃でインキュベートします。 サルモネラ菌亜種の栽培について。 エンテリカ （ATCC 10708）、（125 rpm）し振とうしながら37℃で増殖培地として栄養培地を使用しています。 </li> 圧力の3気圧下で121℃で10分間オートクレーブ処理により各培養物を熱殺します。 5000×gで20分間遠心分離することにより、加熱死菌基板を収穫。タイプ1の水でペレットを3回洗浄し、最小量の水に再懸濁します。本研究では、1200μlの基質を一時停止します。 小分けし、20℃で1.5ミリリットルマイクロチューブや店舗への細菌の細胞基質を300μl。 精製されたペプチドグリカン基板 （ 材料および装置 表を参照）ターゲット基板細菌7-10からペプチドグリカンを精製またはベンダから取得します。アクセサリー細胞壁ポリマーからの粗ペプチドグリカン調製物を精製します。 定性的マイクロスライド拡散アッセイ[Lachicaから変更された、 ら 。11] 注：マイクロスライド拡散アッセイでありますサンプル中の抗菌性酵素の存在を検出するための定性的方法。酵素が基質を含むアガロースマトリックスを通って拡散するように酵素が基質を加水分解したように、クリアのゾーンが開発しています。以下のプロトコルは、定性的タンパク質抗菌剤の存在を検出するためのマイクロスライド拡散アッセイの調製及び性能を説明します。 製造業者のプロトコルに従ってビシンコニン酸（BCA）タンパク質アッセイキットを使用して評価される抗菌剤、酵素の濃度を決定します。 酵素緩衝液としてリン酸緩衝食塩水（PBS）を利用します。しかし、経験的に所定の酵素のための適切なバッファを決定します。 反応緩衝液として、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて、抗菌性酵素の連続希釈を行います。これらのマイクロスライド拡散アッセイにおいて使用される連続希釈は0頁、10頁、100頁、は1ng、10ngの、100ngの、1μgの、1の最終アッセイタンパク質量を製造しました反応体積あたり0μgの。 個々のマイクロチューブへのタンパク質の質量を分注し、反応ウェルをマイクロスライドに加えの準備のためにPBSを用いて20μlにタンパク質のボリュームを調整します。 PBS 50ml中のアガロースを0.25gを溶解し、0.5％アガロース溶液を作ります。アガロースが完全に溶解するまで沸騰に溶液を加熱します。重量溶融プロセス中に失われた水を決定し、この溶液に戻って追加します。 アガロース溶液に水中10％のアジ化ナトリウムの50μLを加え、水浴中で50℃に溶液の温度を調整します。アジ化ナトリウムは、マイクロスライド拡散アッセイのインキュベーション中に細菌増殖を汚染抑制するために添加されます。生存細胞を基質として使用される場合、アガロース溶液からのアジ化ナトリウムを省略する。 氷の上で加熱死菌基板を解凍します。 再懸濁アガロース溶液の12ミリリットル中の細菌の基板は、約2.0 MCFの濁度に合わせて等価標準を（ 材料表を参照してください）アーランド。おおよその濁度が達成されるまでアガロースに細菌の基質を加え、ソリューションを通じて白地に黒い線を可視化することにより、ソリューションの濁度を比較してください。 すぐに各マイクロスライド（25×75×1ミリメートル3）にアガロース基質溶液3mlをピペット。 スライドが固化した後、コルクボーラー（4.8ミリメートル径）を使用して、各マイクロスライドのアガロース基板層に3つのウェルをパンチ。それぞれのウェルにそれぞれ調整されたタンパク質の連続希釈液20μlを追加します。 よく、陰性対照にPBS（20μL）またはウシ血清アルブミン（20μlのPBS中5μg）を使用します。陽性対照として、リゾチームなどの基板に適した既知の溶菌酵素を、使用してください。 37°Cまたは酵素の最適活性温度で湿度チャンバ内のスライドをインキュベートします。インキュベーションの長さは濃度に依存し、抗菌酵素の比活性。典型的な反応時間は一晩（約16時間）です。 インキュベーション後、間接的な光の下でスライドを観察し、約30cmの焦点距離60 mmレンズとデジタル一眼レフカメラを使用して開発アッセイの画像を取り込みます。 注：指定された基板のためのタンパク質の抗菌剤の酵素活性は、酵素は、アガロース中に拡散としてだけでなく周囲に形成し、加水分解のクリアゾーンの開発と相関しています。 酵素活性を修飾するために、各ウェルの周囲に形成領域のサイズを確認します。低い酵素活性を定性的に小さいゾーンに関連しながら、高い酵素活性を定性的に、より大きなゾーンに関するものです。 3.基質の標識-レマゾールブリリアントブルーR色素標識化[周12から変更されました] 注：染料放出アッセイでは、基質は、共有結合であるリンケdはブリリアントブルーR染料をレマゾールします。以下のプロトコルは、染色された酵素基質の調製を記載します。 200mMのレマゾールブリリアントブルーR色素（RBB）溶液を作製するために使用されるタイプIの水99 ml中に1gの水酸化ナトリウムを溶解し250mMの水酸化ナトリウム（NaOH）溶液を作ります。 新鮮な250mMのNaOH溶液（ステップ3.1）の98.75ミリリットル±1ミリリットル中1.25グラムのRBBを溶解することにより、200 mMのRBB液を作ります。 RBB溶液30mlで0.5グラム湿重量の濃度で熱で死滅させた細菌細胞を再懸濁します。精製されたペプチドグリカンについては、RBB溶液30mlで0.3グラム湿重量の濃度のペプチドグリカンを再サスペンド。 穏やかに混合しながら37℃で6時間、回転プラットフォーム上三角フラスコ中の反応混合物をインキュベートします。 4℃のインキュベーターに反応混合物を移し、穏やかに混合しながらさらに12時間インキュベートします。 インキュベーション後、3000×gで遠心分離することによって染色された基板を収穫30分間。基板ペレットから染料溶液をデカント。 遠心分離したタイプIの水で繰り返し（約3〜5回の洗浄）を色素で標識された細胞またはペプチドグリカンを洗浄することにより、基材からの非共有結合した水溶性の染料を削除します。各水の添加により、徹底的にペレットを再懸濁します。 注：結合していない、可溶性染料は、もはや遠心分離後の水洗浄に表示されない場合。基板は、一つの追加の洗浄を与えられるべきです。最後の洗浄の上清が透明になりながら、基板は、青色のままであることに注意してください。 後で使用するために-20℃で最小量の水に懸濁染め基板を保管してください。 4.定量的色素放出アッセイ注：色素放出アッセイの間に、酵素反応のリリースでRBB-染め基質の加水分解は、反応上清中に製品を染め。放出された色素の量の比色測定は、AMO​​を示しています所定の酵素のためのサンプル内に存在する酵素活性のUNT。定量法は、基板全体の異なる酵素の比較を可能にし、酵素反応（ 例えば 、温度、塩分濃度、およびpHを）影響を与える環境条件の変化を可能にします。以下のプロトコルは、定量的にタンパク質の抗菌剤の酵素活性を検出するための色素放出アッセイの調製及び性能を説明します。 色素放出アッセイのための準備冷凍染め基板を室温に戻し、所定の酵素のために経験的に決定されたアッセイ緩​​衝液（PBS）で2回洗浄することを許可します。 実行される色素放出アッセイの数で200μlの反応容量を乗算することにより必要とされる基質懸濁液の体積を計算します。 （光学密度まで、4.1.2で決定し、アッセイ緩​​衝液の体積に染色された基板を追加することによって、基板の懸濁液を調製2.0のOD）を分光光度計を用いて595nmで達成されます。濃縮液の1希釈：分光光度計の機能的な制限内に留まるために、1のための1.0と2.0のOD 595を測定します 。ブランクとしてアッセイ緩​​衝液を使用してください。 注：反応のための基質の濁度は非常に効率的な酵素の活性レベルと一致するように2.0を超えて上昇させることができます。 1mg / mlの推定濃度でアッセイ緩​​衝液中で評価されるタンパク質の抗菌剤をサスペンド。 製造業者のプロトコルに従ってBCAタンパク質アッセイキットのマイクロプレートアッセイを用いて、タンパク質試料の実際の濃度をアッセイすることを決定。 mlのアッセイ緩​​衝液を使用して、/ 1 mgの原料懸濁液の濃度を調整します。 タンパク質抗菌のための最適なインキュベーション条件を決定する色素放出アッセイを使用して、 100 ngの/μlに株式タンパク質抗菌サスペンションを希釈します。この濃度はAFを与えます体積あたりのタンパク質1μgの（10μl）をのinal反応マスをアッセイ反応に加えます。 溶菌タンパク質に関して評価されるべき熱の範囲を決定します。これらのアッセイにおける熱範囲は5℃、15℃、25℃、35℃、45℃、55℃、および65°Cが含まれていました。 0.5ミリリットルマイクロチューブに反応アッセイを行います。それぞれの熱的条件については、準備された基質懸濁液の200μlに株式タンパク質の10μlを添加します。 1時間に1回反転させることによって混合しながら8時間サーマルサイクラーでインキュベートします。 インキュベーションに続いて、エタノールの25μLを加えることによって反応を停止させます。 2分間3000×gの遠心分離により未消化、不溶性基板を取り外し、未消化基板のペレットを破壊しないように注意しながら、96ウェル平底マイクロプレートに各反応混合物のための反応上清150μlのを転送します。 タンパク質antimicrobの酵素活性を測定します可溶性RBB染料の量を決定することによって、与えられた基板にIALは、酵素加水分解後の基板から解離しました。酵素活性を定量化するために、マイクロプレート分光光度計を用いて595nmでの上清の吸光度を測定します。標識された基質からの上清中に放出された可溶性染料により増加した吸光度は、酵素活性の定量的測定です。 注：吸光度の変化を595nmの色素放出反応上清の光学密度は0.01の増加で1 AU結果活性単位（AU）で表されます。酵素以外のすべての反応成分と共にインキュベートブランク反応は、によりインキュベーションにRBB標識基質から放出する任意の染料を減算するために使用されます。最適な酵素温度は、ピーク活性単位の測定値を提供します。 繰り返し抗菌酵素の最適なバッファー条件を決定するために、種々のインキュベーション緩衝液を使用して4.2.7を通じて4.2.1ステップ。トンでHESEアッセイは、PBSを使用します。 タンパク質抗菌のための最適なインキュベーション温度で最小活性濃度を決定するために、色素放出アッセイを使用して、 アッセイ緩​​衝液を使用して株式抗菌タンパク質懸濁液の連続希釈を行います。希釈シリーズの範囲は、抗菌酵素の活性に応じて変化します。これらのアッセイに使用される連続希釈は0頁、10頁、100頁、は1ng、10ngの、100ngの、1μgの、および10μgの最終アッセイタンパク質量を生成しました。 48ウェル平底マイクロプレートの各反応アッセイを行います。各アッセイ条件については、準備された基質懸濁液の200μlに、それぞれのタンパク質懸濁液10μlを追加します。反応緩衝液を用いて、10μLの反応液に加え、タンパク質溶液の体積の変動を調整します。 蒸発による体積変化を回避するために、プレートシーリングフィルムでマイクロプレートを密封します。決定された最適な中で、シェーカーインキュベーターでインキュベート振とうしながら16時間抗菌​​所定のタンパク質のためのcubation温度。 インキュベーション後、各ウェルにエタノールを25μl加えて反応を停止し、2分間3000×gで遠心分離することによって未消化の基板を除去します。 未消化基板のペレットを破壊しないように注意しながら、96ウェル平底マイクロプレートに各反応混合物の反応上清150μlのを転送します。 酵素活性を定量化するために、マイクロプレート分光光度計を用いて595nmでの上清の吸光度を測定します。酵素以外のすべての反応成分と共にインキュベートブランク反応は、によりインキュベーションにRBB標識基質から放出する任意の染料を減算するために使用されます。標識された基質からの上清中に放出された可溶性染料により増加した吸光度は、酵素活性の定量的な尺度を提供します。 注：吸光度の変化は、活性単位（AU）で表され、ここで、1 AU結果に595nmの色素放出反応上清の光学濃度で0.01増加。