Kwalitatieve en Kwantitatieve Testen voor detectie en karakterisering van proteïne Antimicrobials

1. Bereiding van Bacteriële en peptidoglycan Substrates Opmerking: Hele cel bacteriële substraten en gezuiverd peptidoglycanen worden gebruikt als enzymsubstraten in zowel het microscoopglaasje diffusie assay en de kleurstof-afgifte test. Deze substraten vereisen voorbereiding voorafgaand aan het uitvoeren van de enzymreacties. Het volgende protocol beschrijft de bereiding. Hele bacteriële cel Substrate Produceren bacteriële cel substraat door inoculeren van 500 ml voedingsbouillon met 2 ml overnacht cultuur van Bacillus subtilis 168 (American Type Culture Collection, ATCC 23857). Incubeer bij 30 ° C onder schudden (125 rpm) totdat de kweek een exponentiële groeifase, gedefinieerd als een snelle groeifase resulteert in de verdubbeling van de bacteriecultuur bereikt. Voor de teelt van Salmonella enterica subsp. Enterica (ATCC 10708), gebruikt als voedingsbodem groeimedium bij 37 ° C onder schudden (125 rpm). </li> Warmte-doden elke cultuur autoclaaf gedurende 10 minuten bij 121 ° C onder 3 atm druk. Oogst de hitte gedode bacteriële substraat door centrifugatie gedurende 20 minuten bij 5000 x g. Was de pellet driemaal met type 1 water en resuspendeer in een minimale hoeveelheid water. In deze studie, schorten de substraten in 1200 pl. Aliquot 300 pi van de bacteriële cel substraten 1,5 ml microfuge buizen en bewaren bij 20 ° C. Gezuiverd peptidoglycaan Substrate Zuiver peptidoglycan van het doel substraat bacterie 7-10 of het verwerven van een leverancier (zie materialen en apparatuur Table). Zuiver ruwe peptidoglycan voorbereidingen van accessoire celwandpolymeren. 2. Kwalitatieve microscoopglaasje Diffusion test [Aangepast van Lachica, et al. 11] Opmerking: De microscoopglaasje diffusie assayeen kwalitatieve methode om de aanwezigheid van antimicrobiële enzym in een monster. Aangezien het enzym door een agarose matrix substraat diffundeert, een zone van clearing ontwikkelt als het enzym hydrolyseert het substraat. Het volgende protocol beschrijft de voorbereiding en uitvoering van het microscoopglaasje diffusie assay voor kwalitatief detecteren van de aanwezigheid van eiwit antimicrobiële middelen. Bepaal de concentratie van het antimicrobiële enzym worden beoordeeld met behulp van een bicinchoninezuur (BCA) Protein Assay Kit volgens het protocol van de fabrikant. Gebruik fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) een enzym buffer; echter empirisch bepalen de buffer geschikt is voor de gegeven enzym. Voer een seriële verdunning van het antimicrobiële enzym met behulp van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) als reactiebuffer. De seriële verdunning gebruikt in deze microscoopglaasje diffusie assays geproduceerd laatste test eiwit massa van 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 ug, en 10 ug per reactievolume. Verdeel eiwit massa in individuele microcentrifugebuizen en pas eiwit volumes 20 pl PBS gebruiken als voorbereiding voor toevoeging aan reactiewells microscoopglaasje. Voeg een 0,5% agarose-oplossing door het oplossen van 0,25 g agarose in 50 ml PBS. Verwarm de oplossing tot kookpunt totdat de agarose volledig is opgelost. Bepaal waterverlies tijdens het smeltproces gewichtsprocent en weer toevoegen aan de oplossing. Voeg 50 ul van 10% natriumazide in water om de agarose vloeistof en breng de temperatuur van de oplossing tot 50 ° C in een waterbad. Het natriumazide wordt toegevoegd aan verontreinigende remmen bacteriegroei tijdens de incubatie van het microscoopglaasje diffusie assay. Als levensvatbare cellen worden gebruikt als substraat, laat de natriumazide van de agaroseoplossing. Ontdooi de hitte gedode bacteriële substraat op ijs. Resuspendeer de bacteriële substraat in 12 ml van de agarose oplossing ongeveer overeenkomen met de troebelheid van een 2,0 McFArland gelijkwaardigheid norm (zie Materials tabel). Vergelijk de troebelheid van de oplossingen door visualiseren van een zwarte lijn op een witte achtergrond met de oplossingen, toevoeging bacteriële substraat om de agarose tot bij benadering troebelheid bereikt. Onmiddellijk Pipetteer 3 ml agarose-substraatoplossing aan elk microscoopglaasje (25 x 75 x 1 mm 3). Na dia stollen, pons drie putten in de agarose-substraatlaag van elk microscoopglaasje met een kurkboor (4,8 mm diameter). Voeg 20 ul van elk eiwit gecorrigeerde seriële verdunning van hun respectievelijke putjes. Met PBS (20 pl) of runderserumalbumine (5 ug in 20 pl PBS) in een negatieve controle ook. Met bekende bacteriolytische enzymen geschikt voor het substraat, zoals lysozym, als positieve controle. Incubeer de dia in een vochtige kamer bij 37 ° C en de temperatuur optimale activiteit van het enzym. De lengte van de incubatie is afhankelijk van de concentratie enspecifieke activiteit van het antimicrobiële enzym. Een typische reactietijd ligt overnacht (ongeveer 16 uur). Na incubatie, let op de dia's in het kader van indirect licht en foto's maken van de ontwikkeling van test met behulp van een digitale spiegelreflexcamera met een 60 mm lens op een brandpuntsafstand van ongeveer 30 cm. Noot: Enzymatische activiteit van het eiwit van de antimicrobiële bepaald substraat gecorreleerd is met de ontwikkeling van een heldere zone hydrolyse, welke vormen rond en het enzym in de agarose diffundeert. Om de enzymatische activiteit in aanmerking komt, let op de afmetingen van de zones die vormen rond elk putje. Hoge enzymatische activiteit kwalitatief betrekking op een grotere zone, terwijl lage enzymatische activiteit kwalitatief betrekking op een kleinere zone. 3. Substrate Labeling – Remazol Brilliant Blue R Dye Labeling [Modified van Zhou 12] Opmerking: In de kleurstof-afgifte test, het substraat covalent linked om briljante blauwe kleurstof R Remazol. Het volgende protocol beschrijft de bereiding van geverfde enzymsubstraten. Wordt 250 mM natriumhydroxide (NaOH) door het oplossen van 1 g NaOH in 99 ml type I water wordt gebruikt voor het maken van een 200 mM oplossing Remazol briljant blauw R kleurstof (RBB). Wordt 200 mM RBB oplossing door het oplossen van 1,25 g RBB in 98,75 ml ± 1 ml van een verse 250 mM NaOH-oplossing (stap 3,1). Resuspendeer hitte gedode bacteriële cellen bij een concentratie van 0,5 g versgewicht in 30 ml RBB oplossing. Voor gezuiverde peptidoglycaan, resuspendeer de peptidoglycaan in een concentratie van 0,3 g versgewicht in 30 ml RBB oplossing. Incubeer het reactiemengsel in een Erlenmeyer fles op een roterend platform gedurende 6 uur bij 37 ° C onder zachtjes mengen. Breng het reactiemengsel tot 4 ° C incubator en incubeer gedurende nog 12 uur onder zachtjes mengen. Na incubatie, verzamel de geverfde substraat door centrifugatie bij 3000 xggedurende 30 min. Schenk de kleurstofoplossing van het substraat pellet. Verwijder niet-covalent gebonden oplosbare kleurstof van het substraat door het wassen van de kleurstof gemerkte cellen of peptidoglycan herhaaldelijk (ongeveer 3-5 wasbehandelingen) met Type I water gevolgd door centrifugeren. Bij elke toevoeging van water, grondig resuspendeer de pellet. Opmerking: Als geconsolideerd, oplosbare kleurstof niet meer zichtbaar in het waswater na centrifugeren. De ondergrond moet worden gegeven een extra wasbeurt. Merk op dat de ondergrond blauw zal blijven, terwijl de bovenstaande vloeistof van de laatste wasbeurt zal duidelijk zijn. Bewaar de geverfde substraten gesuspendeerd in een minimale hoeveelheid water bij -20 ° C voor later gebruik. 4. Kwantitatieve Dye-afgifte test Noot: Tijdens de kleurstof afgifte assay, de hydrolyse van RBB gekleurd substraat in de enzymreactie releases geverfde producten in de reactie supernatant. Colorimetrie van de hoeveelheid vrijgemaakte kleurstof geeft de amount enzymatische activiteit aanwezig in het monster voor een gegeven enzym. De kwantitatieve werkwijze maakt de vergelijking van verschillende enzymen in substraten en maakt variatie van omgevingscondities beïnvloeden de enzymatische reactie (bijvoorbeeld temperatuur, zoutgehalte, pH). Het volgende protocol beschrijft de voorbereiding en uitvoering van de kleurstof afgifte assay voor het kwantitatief detecteren van de enzymatische activiteit van antimicrobiële eiwitten. Voorbereiding van de Dye-afgifte test Laat de bevroren geverfde substraat op kamertemperatuur en tweemaal wassen met testbuffer (PBS), die empirisch wordt bepaald voor de gegeven enzym. Bereken de hoeveelheid substraat suspensie die nodig is voor de 200 ul reactievolume vermenigvuldigen met het aantal kleurstof afgifte assays uit te voeren. De ondergrond suspensie door toevoeging geverfde substraat om het volume testbuffer, bepaald 4.1.2, totdat een optische dichtheid (OD) van 2,0 wordt bereikt bij 595 nm met een spectrofotometer. In de functionele beperkingen van de spectrofotometer te blijven meten van de OD 2,0 1,0 595 als een 1: 1 verdunning van de geconcentreerde oplossing. Gebruik assay buffer als blanco. Opmerking: Het substraat troebelheid van de reactie kan worden verhoogd dan 2,0 om de activiteitsniveaus van zeer efficiënte enzymen passen. Schorsen de antimicrobiële eiwit te evalueren in assaybuffer bij een concentratie van ongeveer 1 mg / ml. Met de microplaat assay van een BCA Protein Assay Kit volgens het protocol van de fabrikant, werd de werkelijke concentratie van het eiwit te bepalen monster. Dient de concentratie van de voorraadsuspensie tot 1 mg / ml met behulp testbuffer. Met behulp van de Dye-afgifte test om te bepalen van de optimale Incubation Voorwaarden voor een eiwit Antimicrobial Verdun de voorraad proteïne antimicrobiële schorsing tot 100 ng / ul. Deze concentratie geeft afspronkelijke reactiemassa van 1 ug eiwit per volume (10 ui) toegevoegd aan de reactie assay. Bepaal het thermische bereik te worden beoordeeld op de bacteriolytisch eiwit. De verbrandingswaarde in deze testen onder 5 ° C, 15 ° C, 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C, 55 ° C en 65 ° C. Voer het reactiemengsel assays 0,5 ml microcentrifugebuizen. Voor iedere thermische toestand, voeg 10 ul van de voorraad eiwitten tot 200 ul van voorbereide ondergrond schorsing. Incubeer in een thermische cycler voor 8 uur onder mengen door omkeren eenmaal per uur. Na incubatie aanhouding van de reacties door het toevoegen van 25 ul van ethanol. Verwijderen onverteerd, onoplosbare substraat door centrifugeren bij 3000 xg gedurende 2 minuten, en breng 150 ul van de supernatant per reactie reactiemengsel een 96 putjes met vlakke bodem microplaat, verzorgen de pellet onverteerd substraat niet te verstoren. Meet enzymatische activiteit van het eiwit Antimicrobial voor de gegeven substraat door de hoeveelheid van oplosbare kleurstof RBB losgemaakt van het substraat na enzymatische hydrolyse. Om de enzymatische activiteit te kwantificeren, meet de absorptie van de supernatant bij 595 nm onder toepassing van een microplaat spectrofotometer. Verhoogde absorptie door de oplosbare kleurstof afgegeven in de bovenstaande vloeistof van het gemerkte substraat een kwantitatieve meting van enzymatische activiteit. Opmerking: De verandering in absorptie wordt vertegenwoordigd door activiteitseenheden (AU), waarbij 1 AU resulteert in een 0,01 toename in de optische dichtheid van de kleurstof afgifte reactie supernatant bij 595 nm. Een blanco reactie, geïncubeerd met alle reactiecomponenten behalve enzym wordt gebruikt om kleurstof die loskomt uit de RBB-gemerkt substraat door de incubatie aftrekken. De optimale enzymatische temperatuur biedt de piek activiteit unit meting. Herhaal stappen 4.2.1 tot 4.2.7 middels verschillende incubatie buffers, de optimale bufferomstandigheden voor antimicrobiële enzym te bepalen. in tHese assays, gebruik PBS. Met de Dye-afgifte test aan de minimale actieve concentratie de optimale incubatietemperatuur bepalen voor een eiwit Antimicrobial Voer een seriële verdunning van de voorraad antimicrobiële eiwitten suspensie op met assay buffer. De verdunningsreeks bereik zal variëren met de werkzaamheid van het antimicrobiële enzym. De seriële verdunning gebruikt in deze assays geproduceerd eindassayconcentratie eiwit hoeveelheden 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 ug en 10 ug. Voer elke reactie test in een 48-well vlakke bodem microplaat. Voor elke assay staat, voeg 10 ul van de respectievelijke eiwitsuspensie tot 200 gl voorbereide ondergrond suspensie. Stel dat veranderingen in het volume van de eiwitoplossing aan het reactiemengsel toegevoegd aan 10 ui reactiebuffer gebruik. Sluit de microplaat met plaat afdichting film om het volume te variëren door verdamping te voorkomen. Incubeer in een shaker incubator bij de bepaalde optimale incubation temperatuur voor de gegeven eiwit antimicrobiële gedurende 16 uur onder schudden. Na incubatie aanhouding van de reactie door toevoeging van 25 gl ethanol aan elk putje en verwijderen onverteerde substraat door centrifugeren bij 3000 xg gedurende 2 minuten. Transfer 150 ul van de supernatant per reactie reactiemengsel een 96 putjes met vlakke bodem microplaat, verzorgen de pellet van de onverteerde substraat niet te verstoren. Om de enzymatische activiteit te kwantificeren, meet de absorptie van de supernatant bij 595 nm onder toepassing van een microplaat spectrofotometer. Een blanco reactie, geïncubeerd met alle reactiecomponenten behalve enzym wordt gebruikt om kleurstof die loskomt uit de RBB-gemerkt substraat door de incubatie aftrekken. Verhoogde absorptie door de oplosbare kleurstof afgegeven in de bovenstaande vloeistof van het gemerkte substraat een kwantitatieve maat voor enzymatische activiteit. Opmerking: De verandering in absorptie wordt vertegenwoordigd door activiteiten eenheden (AU), waarbij 1 AU resultaten ineen 0,01 toename in de optische dichtheid van de kleurstof afgifte reactie supernatant bij 595 nm.