JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

מבחנים איכותיים וכמוני עבור זיהוי ואפיון של antimicrobials החלבון

Published: April 10, 2016
doi:
10.3791/53819
, ,
1Department of Advanced Technology,The MITRE Corporation, 2Center for Biomedical Engineering,Brown University, 3The MITRE Corporation

Summary

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Abstract

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Introduction

Antimicrobial agents play an essential role in targeting a wide range of microorganisms such as viruses, fungi, and bacteria. The antimicrobial activities produced by various bacteria range in target specificity from broad-spectrum to species-specific, including clinically relevant bacterial pathogens 1. In nature, protein antimicrobial compounds like bacteriocins and lysins represent a microbial arsenal of tools for self-defense, replication, and nutrient acquisition 2,3. Serving as mediators of population dynamics within microbial communities, protein antimicrobials provide a competitive advantage to the producing organism over nonproducing, sensitive species 4. As recombinant enzymes and probiotics, these proteins also have an economic and societal importance as the need for new sources of pathogen control increases with each new expansion of antimicrobial resistance within the bacterial population 5.

The first evaluations of newly discovered protein antimicrobials include determining the basic physical characteristics that are inherent to the enzyme. Methods for rapid screening of potential antimicrobials allow selection of candidates with hydrolytic activities against the desired target substrates. The microslide diffusion assay and the quantitative dye-release assay allow for the use of a variety of substrates in the detection of enzymatic hydrolysis. For protein antimicrobial enzymes with activity against the bacterial cell wall, the versatility of these assays allow rapid and effective, qualitative and quantitative screening against viable bacterial cells (microslide assay only), heat-killed whole bacterial cell substrates, or purified peptidoglycan from the target bacterium. These assays have utility in antimicrobial enzyme discovery for use in fields such as alternative therapeutics, food supplements, and inhibitors of biofilm production.

The microslide diffusion assay and the dye-release assay are demonstrated methods for detection and characterization of novel protein antimicrobials. The microslide diffusion assay provides a relative (qualitative) estimate of antimicrobial activity and allows for minimal inference of enzyme concentration and activity. Using this method, activity is readily visualized as the development of a zone of lysis with the absence of activity resulting in a lack of zone formation. The rate of zone development and the zone diameter are indicative of the amount and purity of the enzyme present in the sample; however, this rate and the quality of the substrate clearing within the zone can also be affected by the presence of contaminants, the completeness of the hydrolysis reaction, and the type of substrate. Interfering contaminants can affect the rate of enzyme diffusion from the well, while incomplete hydrolysis or variation of the substrate type can result in a turbid zone of lysis 6.

The dye-release assay quantitatively assesses the amount of covalently-linked Remazol brilliant blue R dye products released into the reaction supernatant from the enzymatically hydrolyzed substrate. The method has only slight variability associated with a difference in substrate, thus allowing greater sensitivity for detection of hydrolysis as compared to the microslide diffusion assay. These properties allow the method to have utility in the characterization of biochemical properties of the enzyme and in the standardization of the assay for comparison between different antimicrobial enzymes.

In this protocol, we provide methods to perform the basic microslide diffusion assay and dye-release assay, while demonstrating the scale of detection limits and variability for each. The assays are used to perform basic evaluations of an unknown protein antimicrobial purified from the culture supernatant of an uncharacterized soil bacterial isolate. Observed activities against bacterial cell substrates within the assays allow comparison of reaction activities between a previously uncharacterized protein antimicrobial and α-chymotrypsin, a control proteolytic enzymes. These protocols provide a foundation for the application of the two techniques that can be expanded and modified to accommodate varied applications.

Protocol

1. הכנת חיידקים פפטידוגליקן מצעים הערה: מצעים חיידקי שלמות תא ואת פפטידוגליקן מטוהרים משמשים מצעי אנזים הוא assay דיפוזיה microslide ואת assay צבען השחרור. מצעים אלו דורשים הכנה לפני ביצוע תגובות האנזים. הפרוטוקול הבא מתאר בעריכתם. מצע שלמות תא בקטריאלי לייצר המצע תא החיידק על ידי יחסנו 500 מ"ל של מרק מזין עם תרבות הלילה 2 מ"ל של Bacillus subtilis 168 (אוסף התרבות האמריקאית סוג; ATCC 23,857). לדגור על 30 מעלות צלזיוס עם רועד (125 סל"ד) עד התרבות מגיעה שלב מעריכים של צמיחה, כפי שהוגדר בשלב צמיחה מהיר וכתוצאה מכך להכפלת תרבות החיידקים. לגידול של subsp enterica סלמונלה. Enterica (ATCC 10708), השתמש מרק מזין כמדיום הצמיחה ב 37 ° C עם רועד (125 סל"ד). </li> חום להרוג אחד את התרבות על ידי מעוקר במשך 10 דקות ב 121 מעלות צלזיוס מתחת 3 ATM של לחץ. קציר את מצע חיידקים-נהרג חום על ידי צנטריפוגה במשך 20 דקות ב 5000 x ז. שטפו את הכדור שלוש פעמים עם מים סוג 1 מחדש להשעות בתוך לכמות מינימלית של מים. במחקר זה, להפקיע מצעים ב -1,200 μl. Aliquot 300 μl של מצעים תא החיידק 1.5 מ"ל צינורות microfuge ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. מצע פפטידוגליקן מטוהר לטהר פפטידוגליקן מחיידק מצע היעד 7-10 או לרכוש מהספק (ראה חומרים וציוד טבלה). לטהר הכנות פפטידוגליקן גולמיות פולימרי דופן תא אבזר. 2. Assay דיפוזיה איכותי Microslide [השתנה מן Lachica, et al. 11] הערה: assay דיפוזיה microslide הואשיטה איכותית לגילוי הנוכחות של אנזים מיקרוביאלית במדגם. כפי האנזים מפזר באמצעות מצע המכיל מטריקס agarose, אזור הסליקה מתפתח האנזים hydrolyzes המצע. הפרוטוקול הבא מתאר את ההכנה וביצועים של assay דיפוזיה microslide עבור איכותי לגילוי הנוכחות של antimicrobials חלבון. קבע את הריכוז של האנזים מיקרוביאלית להיבדק באמצעות ערכת Assay חלבון Bicinchoninic חומצה (BCA) על פי פרוטוקול של היצרן. לנצל בופר פוספט (PBS) כחוצץ אנזים; עם זאת, לקבוע את המאגר מתאים באופן אמפירי את האנזים הנתון. בצע דילול סדרתי של האנזים מיקרוביאלית באמצעות בופר פוספט (PBS) כחיץ התגובה. דילול סדרתי המשמש מבחני דיפוזיה microslide אלה מיוצר ההמונים חלבון assay הסופי של 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 מיקרוגרם, ו 10 מיקרוגרם לכל עוצמת התגובה. לוותר המוני חלבון לתוך צינורות microfuge פרט להתאים כמויות חלבון 20 μl באמצעות PBS כהכנה בנוסף microslide בארות תגובה. בצע פתרון agarose 0.5% על ידי המסת 0.25 גרם של agarose ב 50 מ"ל של PBS. מחממים את הפתרון לרתיחה עד agarose נמס לגמרי. לקבוע מים אבדו במהלך תהליך ההיתוך לפי משקל ולהוסיף חזרת הפתרון. הוסף 50 μl של אזיד הנתרן 10% במים לפתרון agarose ולהתאים את הטמפרטורה של הפתרון 50 ° צלזיוס באמבט מים. אזיד הנתרן מתווסף לעכב זיהום התפתחות חיידקים במהלך הדגירה של assay דיפוזיה microslide. אם תאים קיימא משמשים מצע, להשמיט את אזיד הנתרן מפתרון agarose. להפשיר את מצע חיידקים-נהרג חום על קרח. Re- להשעות את המצע חיידקי 12 מ"ל של התמיסה agarose בכ להתאים את העכירות של 2.0 MCFArland שקילה סטנדרטית (ראה לוח חומרים). השווה את turbidities של הפתרונים על ידי הדמית קו שחור על רקע לבן דרך הפתרונים, הוספת מצע בקטריאלי אל agarose עד העכירות המשוערות מושגות. מיד pipet 3 מ"ל של הפתרון agarose-המצע לכל microslide (25 x 75 x 1 מ"מ 3). לאחר שקופיות לחזק, אגרוף שלוש בארות בשכבת agarose-המצע של כל microslide באמצעות מקדח הפקק (4.8 מ"מ קוטר). הוסף 20 μl של כל דילול סדרתי חלבון מתואם לבארות שלהם. השתמש PBS (20 μl) או אלבומין בסרום שור (5 מיקרוגרם ב 20 PBS μl) ב כביקורת שלילית גם. השתמש ידועים אנזימי bacteriolytic מתאימים המצע, כגון ליזוזים, כביקורת חיובית. דגירת השקופיות בתא לחות על 37 מעלות צלזיוס או טמפרטורת הפעילות האופטימלית של האנזים. אורכו של הדגירה תלוי ריכוזפעילות ספציפית של אנזים מיקרוביאלית. זמן תגובה אופייני הוא לילה (כ 16 שעות). לאחר דגירה, להתבונן השקופיות תחת תמונות אור ללכוד עקיפה של assay בפיתוח באמצעות מצלמת רפלקס דיגיטלית עדשה אחת עם עדשה 60 מ"מ ממרחק מוקד של כ 30 ס"מ. הערה: הפעילות האנזימטית של מיקרוביאלית חלבון המצע נתון בקורלציה עם התפתחות אזור ברורה של הידרוליזה, המהווה ברחבי גם את האנזים מתמוסס לתוך agarose. כדי לאפיין את הפעילות האנזימטית, לקיים את הגדלים של אזורים היוצרות סביב כל טוב. פעילות האנזימטית גבוהה מתייחסת איכותית לאזור גדול יותר, ואילו פעילות האנזימטית נמוכה איכותית מתייחסת לאזור קטן יותר. 3. תיוג מצע – Remazol תיוג דיי R הכחול המבריק [השתנה מן ג'ואו 12] הערה: ב assay צבען שחרור, המצע הוא קוולנטית לינקהד כדי Remazol לצבוע R כחול מבריק. הפרוטוקול הבא מתאר את הכנת מצעי אנזים צבועים. כן נתרן הידרוקסידי 250 מ"מ (NaOH) פתרון על ידי המסת 1 גרם NaOH ב 99 מיליליטר מים אני סוג כדי לשמש להכנת צבע R כחול מבריק Remazol 200 מ"מ פתרון (RBB). בצע פתרון 200 מ"מ RBB ידי המסת RBB 1.25 גרם 98.75 מ"ל ± 1 מ"ל של פתרון 250 מ"מ NaOH טריים (שלב 3.1). Re- להשעות תאים חיידקיים-נהרג חום בריכוז של משקל רטוב 0.5 גרם ב 30 מ"ל של תמיסת RBB. לקבלת פפטידוגליקן מטוהרים, מחדש להשעות את פפטידוגליקן בריכוז של משקל רטוב 0.3 גרם ב 30 מ"ל של תמיסת RBB. דגירת תערובת התגובה בתוך בקבוק Erlenmeyer על במה מסתובב במשך 6 שעות ב 37 ° C עם ערבוב עדין. מעבירים את התערובת התגובה C חממה 4 °, דגירה במשך 12 שעות נוספות עם ערבוב עדין. לאחר דגירה, לקצור את המצע צבוע על ידי צנטריפוגה ב 3000 XGלמשך 30 דקות. למזוג את הפתרון לצבוע מן גלולת המצע. הסר צבע מסיס שאינו מקושר קוולנטית מן מצעים ידי שטיפת התאים שכותרתו לצבוע או פפטידוגליקן שוב ושוב (כ 3-5 שוטף) עם מים אני סוג ואחריו צנטריפוגה. עם כל תוספת מים, מחדש להשעות את הגלולה ביסודיות. הערה: כאשר הצבע מאוגד, מסיס כבר אינו נראה לעין בכביסת המים לאחר צנטריפוגה. המצע צריך להינתן לשטוף נוספת אחת. ראוי לציין, כי המצע יישאר כחול, בעוד supernatant של לשטוף האחרון יהיה ברור. אחסן את המצעים הצבועים מרחפי כמות מזערית של מים ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר. 4. כמוני צבען השחרור Assay הערה: במהלך assay צבען השחרור, הידרוליזה של מצע צבוע RBB בגרסאת התגובה האנזימטית צבועה מוצרים לתוך supernatant התגובה. מדידת מדד-צבע מהסכום לצבוע שוחרר מציינת את amount של פעילות האנזימטית נוכחית בתוך המדגם עבור אנזים נתון. השיטה הכמותית מאפשרת השוואה של אנזימים שונים ברחבי מצעים ומאפשרת וריאציה של תנאים סביבתיים המשפיעים על התגובה האנזימטית (למשל, טמפרטורה, מליחות, ו- pH). הפרוטוקול הבא מתאר את ההכנה וביצועים של assay צבען השחרור לגילוי כמוני את הפעילות האנזימטית של antimicrobials חלבון. הכנת Assay השחרור-דיי אפשר המצע הצבוע הקפוא לחזור לטמפרטורת חדר ולשטוף פעמים עם חיץ assay (PBS), אשר נקבע באופן אמפירי את האנזים הנתון. חשב את נפח ההשעיה המצע מה שצריך על ידי הכפלת נפח התגובה 200 μl במספר מבחני צבען שחרור להתבצע. הכן את ההשעיה המצע על ידי הוספת מצע צבוע להיקף חיץ assay, שנקבע 4.1.2, עד צפיפות אופטית (OD) של 2.0 מושגת 595 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. כדי להישאר בתוך המגבלות התפקודיות של ספקטרופוטומטר, למדוד את 2.0 OD 595 כמו 1.0 עבור דילול 1: 1 של הפתרון המרוכז. השתמש חיץ assay בתור ריק. הערה: עכירות המצע עבור התגובה ניתן להעלות מעבר 2.0 כדי להתאים את רמת הפעילות של אנזימים יעילים ביותר. להשעות את מיקרוביאלית חלבון להיבדק חיץ assay לעבר ריכוז מוערך של 1 מ"ג / מ"ל. באמצעות assay microplate של ערכת Assay חלבון BCA על פי הפרוטוקול של היצרן, לקבוע את ריכוז בפועל של מדגם החלבון להיות assayed. התאם את הריכוז של השעיה המניה עד 1 מ"ג / מ"ל ​​באמצעות חיץ assay. באמצעות assay לשחרור-דיי כדי לקבוע את תנאי דגירה אופטימלית של חלבון Antimicrobial לדלל את ההשעיה מיקרוביאלית חלבון המניות 100 ng / μl. ריכוז זה נותן afמסת תגובת Inal של 1 מיקרוגרם חלבון לכל נפח (10 μl) להוסיף תגובת assay. קבע את טווח התרמית יוערך לחלבון bacteriolytic. טווח תרמי המבחנים אלה כלל C ° 5, 15 ° C, 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C, 55 ° C, 65 ° C. בצעו את מבחני התגובה צינורות 0.5 מ"ל microfuge. עבור כל תנאי תרמית, להוסיף 10 μl של חלבון מניות 200 μl של השעית מצע מוכנה. מדגירים את Cycler תרמית במשך 8 שעות עם ערבוב על ידי היפוך פעם לשעה. לאחר דגירה, לעצור את התגובות על ידי הוספת 25 μl של אתנול. סר מעוכל, מצע מסיס על ידי צנטריפוגה ב 3000 XG במשך 2 דקות, ולהעביר 150 μl של supernatant התגובה לכל תערובת תגובה על microplate 96-גם שטוח תחתון, נזהר שלא לשבש את הגלולה של מצע מעוכל. מדוד הפעילות האנזימטית של החלבון antimicrobIAL עבור המצע הנתון על ידי קביעת הסכום של צבע מסיס RBB ניתק מן המצע לאחר הידרוליזה אנזימטית. כדי לכמת את הפעילות האנזימטית, למדוד את הספיגה של supernatant ב 595 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר microplate. ספיגה גדלה על ידי הצבע המסיס מתפזר supernatant מן המצע שכותרתו היא מדידת כמותית של פעילות האנזימטית. הערה: השינוי הספיג מיוצג על ידי יחידות פעילות (AU), כאשר 1 תוצאות AU לעלייה 0.01 ב הצפיפות האופטית של supernatant תגובת צבען שחרורו ב 595 ננומטר. תגובה ריקה, מודגרות עם כל מרכיבי התגובה מלבד אנזים, משמשת לחסר כל צבע משחרר מן המצע RBB שכותרתו בשל הדגירה. הטמפרטורה האנזימטית האופטימלית מספקת מדידת יחידת שיא פעילות. חזור על שלבי 4.2.1 דרך 4.2.7 באמצעות מאגרי דגירה שונים, כדי לקבוע את תנאי חיץ האופטימליים עבור האנזים מיקרוביאלית. בשנת tמבחני hese, השתמשו PBS. באמצעות assay לשחרור-דיי כדי לקבוע את ריכוז הפעילות המינימאלי בטמפרטורה האופטימלית הדגירה של חלבון Antimicrobial בצע דילול סדרה של השעית חלבון מיקרוביאלית המניות באמצעות חיץ assay. טווח סדרת הדילול ישתנה עם פעילותו של האנזים מיקרוביאלית. דילול סדרה המשמש מבחנים אלה מיוצר בכמויות חלבון assay סופיות של 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 מיקרוגרם, ו -10 מיקרוגרם. בצע assay כל תגובה בתוך microplate התחתונה 48-גם שטוח. עבור כל תנאי assay, להוסיף 10 μl של השעית חלבון בהתאמה 200 μl של השעית מצע מוכנה. התאם כל וריאציה בנפח של הפתרון חלבון להוסיף תגובה 10 μl באמצעות חיץ התגובה. חותם את microplate עם סרט איטום צלחת להימנע וריאצית נפח עקב התאדות. דגירת באינקובטור שייקר בבית האופטימלי הנחושטמפרטורת cubation לחלבון הנתון מיקרוביאלית במשך 16 שעות עם רעד. לאחר דגירה, לעצור את התגובה על ידי הוספת 25 μl של אתנול היטב כל ולהסיר מצע מעוכל על ידי צנטריפוגה ב 3000 XG במשך 2 דקות. העבר 150 μl של supernatant התגובה לכל תערובת תגובה על microplate 96-גם שטוח תחתון, נזהר שלא לשבש את הגלולה של המצע המעוכל. כדי לכמת את הפעילות האנזימטית, למדוד את הספיגה של supernatant ב 595 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר microplate. תגובה ריקה, מודגרות עם כל מרכיבי התגובה מלבד אנזים, משמשת לחסר כל צבע משחרר מן המצע RBB שכותרתו בשל הדגירה. ספיגה גדלה על ידי הצבע המסיס מתפזר supernatant מן המצע שכותרתו מספקת מדד כמותי פעילות האנזימטית. הערה: השינוי ספיגת מיוצג על ידי יחידות פעילות (AU), כאשר 1 תוצאות AU ב0.01 עלייה של הצפיפות האופטית של supernatant תגובת צבען שחרורו ב 595 ננומטר.

Representative Results

את assay דיפוזיה microslide ואת assay צבען שחרור כמותית הם שיטות יעילות לסינון ומדידת תחקיר ראשוני של antimicrobials החלבון החדש. יש assay כל יתרונות ומגבלות; עם זאת, כאשר היא מבוצעת בשיתוף, הם מאפשרים סינון ראשוני מהיר ואפיון בסיסי של מיקרוביאלית. את assay דיפוזיה microslide מאפשר ביעילות להקרנה מהירה של ספריות מיקרוביאלי, ייצור antimicrobials חלבון. כאשר רמות ריכוז האנזים הן בעלי העניין, רגישות של אילוצי זיהוי עלולה להגביל את assay, הדורשת כמות גדולה יותר של אנזים שיתווסף התגובה היטב מאשר assay צבען השחרור. כמו באיור 1, המאפיינים האיכותיים של assay לאפשר לצופה להשוות כמויות אנזים ביחס נוכחיות בתוך כל טוב. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> ב אזור הפיתוח של התפרקות באיור 1A (25 מיקרוגרם של אנזים), את הקצה המוביל של האזור מציג תמוגה עכורה או לא שלמה של המצע, בזמן שהאזור קרוב הבאר מציג תמוגה מצע שלם יותר. תופעה זו, תוצר של הריכוז הפוחת של האנזים לשדר בחוד החנית, מסבכת את המדידה המדויקת של קוטר האזור. ככל B בארות (15 מיקרוגרם), C (10 מיקרוגרם), ד '(5 מיקרוגרם), E (1.0 מיקרוגרם), ו- F (0.1 מיקרוגרם) הם נצפו באיור 1, בקוטר של אזור לתמס המלא מתפוגג להכחדה התאמת לסכום של אנזים המופחת. למצב F (0.1 מיקרוגרם), ריכוז האנזים בתוך agarose נמוכה מהגבול שיאפשר האנזים לשדר להיות דמיינו כפי שהוא נע דרך agarose, hydrolyzing המצע. את assay דיפוזיה microslide היה גם להפעיל באמצעות pepti subtilis Bacillus מטוהריםdoglycan כמו מצע (איור 2). בזמן שהאזור פחות מוגדר מאלה שנצפו עם enterica כל תא סלמונלה בשל הרתיעה של פפטידוגליקן להשעות באופן שווה ב agarose, הידרוליזה של פפטידוגליקן ידי האנזים מיקרוביאלית הידוע ניכרת. את assay צבען שחרורו הוא assay רגיש יותר תכליתי מאשר assay דיפוזיה microslide, המאפשר להגביל את גילוי נמוך וריאציה של גורמים סביבתיים המשפיעים על תגובת האנזים. ב מבחני נציג, הטמפרטורה היתה מגוונת כדי לקבוע את הטמפרטורה האופטימלית עבור האנזים מיקרוביאלית, נחושה בדעתה להיות 35 מעלות צלזיוס PBS (איור 3). אופטימלי זה נראה בבירור את supernatants התגובה כפי כמויות מוגברות של צבע הכחול (איור 3) וכן ייצג ביחידות פעילות הנגזר ממדידות ספיגות ב 595 ננומטר (איור 3 א). הצדדי של assay צבען השחרור מאפשר לחוקר להשתנות לא רק טמפרטורות אלא גם למאגר התגובה ורכיבי חיץ כדי לקבוע תנאי דגירה אופטימליים במהירות עבור אנזים נתון. רמת הפעילות של האנזים מיקרוביאלית הידוע (איור 4) ואת אנזים שליטת chymotrypsin α (איור 5) נמדדה בטמפרטורת הדגירה אופטימלית נקבעה 35 מעלות צלזיוס PBS נגד subtilis Bacillus שכותרתו RBB מצע חום-הרג. השוואת תוצאות איור 4 ואיור 5 עולה כי האנזים מיקרוביאלית הידוע יש כמעט פי שתיים הזיקה B. מצע subtilis. בנוסף, השליטה α-chymotrypsin לא לגמרי לעכל את B.-נהרג חום subtilis מצע בתוך הבאר (מידע לא מוצג). הפעילות של שליטת chymotrypsin α מתחילה צלחתau סביב 0.3 מיקרוגרם לעומת המשך עליית יחידות פעילות בכל כמויות האנזים עבור האנזים מיקרוביאלית הידוע (איור 4 ואיור 5). הדבר עשוי להעיד כי האנזים הידוע יש פעילות מתמשכת יותר או שיש מספר גדול יותר של אתרים מחשוף לרשות האנזים בתוך B. מצע subtilis. איור 1:. פעילות האנזים נגד התשתית שלמות התא enterica סלמונלה את assay דיפוזיה microslide שימש איכותית כדי להעריך את פעילותו של חלבון ידוע מיקרוביאלית נגד subsp enterica סלמונלה-נהרג חום enterica (ATCC 10708).. המוני החלבון של מיקרוביאלית הידועה המרחפים פוספט שנאגר מלוח (PBS) כי נוספו בארות בהתאמה שלהשקופיות כלל 25 מיקרוגרם (באר), 15 מיקרוגרם (טוב B), 10 מיקרוגרם (גם C), 5 מיקרוגרם (טוב D), 1 מיקרוגרם (גם E), ו -0.1 מיקרוגרם (טוב F). PBS לבד שמש הבקרות השליליות של המבחנים. האזורים לתמס הם צלמו לאחר דגירת hr 6. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2:. פעילות האנזים נגד subtilis Bacillus פפטידוגליקן Cell החומה assay דיפוזיה microslide שימש איכותית להעריך את פעילותו של חלבון ידוע מיקרוביאלית נגד פפטידוגליקן של Bacillus subtilis 168. נתלה ב 20 μl של PBS, 10 מיקרוגרם של מיקרוביאלית הידועה התווסף גם א 'של microslides. PBS לבד שמש שלילימלא עבור assay (טוב B). אזור לתמס היה צלם לאחר דגירת 6 שעות על 37 מעלות צלזיוס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3:. טמפרטורת תגובה אופטימלית של חלבון אנטימיקרוביים הרבגוניות של assay-השחרור לצבוע מאפשרת הווריאציה של פרמטרים פיסיקליים וכימיים, כגון טמפרטורות דגירה או מאגר, כדי לקבוע ההשפעות שלהם על פעילות אנזים עניין 6. כפי שמודגם באיור זה, על פעילות מיקרוביאלית החלבון הידועה (1 מיקרוגרם) הוערכה ב PBS נגד RBB שכותרתו שחוט חום subtilis Bacillus תחת מגוון של טמפרטורות דגירה. מוצג כיחידות פעילות (AU) ב (א), ספיגת-b RBBound מוצרים מתפזרים supernatant לאחר הידרוליזה נמדדה ב 595 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר microplate. בכל מצב טמפרטורה, תגובות ללא אנזים הוסיף שמשו להפחית את ההשפעות של כל צבע שוחרר נובעות דגירה בטמפרטורה השונה. את supernatants התגובה מתאים לכל אחד טמפרטורת דגירה הם צלמו לפני המדידה ספיגה (B). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 4:. טווח פעילות של חלבון אנטימיקרוביים טווח הפעילות עבור מיקרוביאלית החלבון הידועה נמדד כיחידות פעילות לאחר incubations הלילה עבור 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, ו -1,000 ng , כפי שהיא נמדדת על ידי prot BCAassay עין (א). לתגובות אלו, RBB שכותרתו B. subtilis מצע הרמה הוגדלה לתת צפיפות אופטית של 5.0 ב 595 ננומטר על מנת להבטיח כי התגובה עם הסכום הגבוה ביותר של אנזים (1,000 נ"ג) לא לגמרי hydrolyze כל המצע הזמין בתוך תקופת דגירת תגובה. תגובות שליטות ללא אנזים הוסיף שמשו להפחית את ההשפעות של כל צבע שוחרר הנגרם על ידי הדגירה לבד. את supernatants התגובה מתאים לכל אחד מסכומי אנזים הם צלמו לפני מדידות ספיגות (B). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 5:. טווח פעילות עבור α-chymotrypsin טווח הפעילות-chymotrypsin α נמדד כמו Activיחידות ity לאחר incubations לילה עבור 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, ו -1,000 ng של האנזים (א). לתגובות אלו, RBB שכותרתו B. subtilis מצע הרמה הוגדלה לתת צפיפות אופטית של 5.0 ב 595 ננומטר על מנת להבטיח כי התגובה עם הסכום הגבוה ביותר של אנזים (1,000 נ"ג) לא לגמרי hydrolyze כל המצע הזמין בתוך תקופת דגירת תגובה. תגובות שליטות ללא אנזים הוסיף שמשו להפחית את ההשפעות של כל צבע שוחרר הנגרם על ידי הדגירה לבד. את supernatants התגובה מתאים לכל אחד מסכומי אנזים הם צלמו לפני מדידות ספיגות (B). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

את assay דיפוזיה microslide ואת assay-שחרור לצבוע לספק יתרונות לגילוי ואפיון antimicrobials חלבון מזוהה קודם לכן. שיטות מהירות ורגישות אלה מאפשרות הקרנת תפוקה גבוהה של ספריות מקור אורגניזם לזיהוי אנזימים של עניין לפני השקעת משאבים במחקר גדול. כמו אנזימים היעד פרופיל גבוה מזוהים, וריאציות של מבחני זיהוי שניתן להשתמש בהם כדי לזהות את האנזים במהירות או כדי לקבוע מאפיינים ביוכימיים של האנזים. לדוגמא, במהלך תכנית טיהור חלבונים רבה שלבים, assay דיפוזיה microslide יכול לזהות במהירות שברים המכילים את אנזים עניין. בנוסף, אופטימה תגובה עבור האנזים יכולה להיקבע על ידי שינוי מאגרי התגובה וטמפרטורות דגירה ב assay צבען השחרור.

טווח המסה האנזים הדרוש לגילוי ב assay דיפוזיה microslide היא פונקציה של characteri אנזיםstics. מגבלות איתור של assay בדרך כלל דורשים את השימוש כמויות גדולות יותר של האנזים מאשר assay צבען שחרור. במחקר זה, השוואה של מגבלות זיהוי של assay דיפוזיה microslide (איור 1) אל assay-השחרור לצבוע (איור 4) מאוירת כי assay דיפוזיה microslide הוא טכניקה רגישה פחות assay צבען השחרור. כאשר ריכוז אנזים הוא לא חשש, assay microslide מאפשר סינון ראשוני מהיר של ספריות לייצור antimicrobials חלבון נגד מצעי יעד עם דרישות עבודה וציוד נמוכות. למרות הדורשים יותר מאמץ וציוד, assay-השחרור לצבוע רגיש יותר לשחזור, מניב תוצאות כמותיות המאפשרות השוואה בין מבחנים-שחרור לצבוע של אנזימים זהים או שונים עבור מצע נתון. שתי השיטות מבוצעות בקלות ברוב מעבדות מיקרוביולוגית ללא צורך במכשור מיוחד מאוד. בשנות ה representaמבחנים מופרזים, האנזים השליט, α-chymotrypsin, זוהה על סכומים נמוכים כמו 100 ננוגרם (איור 5) באמצעות assay צבען השחרור, בעוד הכמות המינימאלית זוהתה assay דיפוזיה microslide הייתה 1 מיקרוגרם (מידע לא מוצג).

מתן שירות כמו assay זיהוי איכותי אנזימים מיקרוביאלית, מספר וריאציות של assay דיפוזיה דווח 11,13. לאחר בדיקת מבחנים אלה, assay דיפוזיה microslide פותח עבור הרגישות הגבוהה יחסית שלה כמסך ראשוני שלה להקל שמירת תגובה. שונה מן העבודה של Lachica et al. 11, שבו שכבות agarose שמשו כדי לזהות את הייצור של nucleases ידי זנים של Staphylococcus aureus, assay דיפוזיה microslide פועל באופן דומה לשיטת immunodiffusion רדיאלי 14 כמו החלבון מפזר מהבאר אל agarose המכיל את המצע. Immunodiffu רדיאלישיטת שיאון עוצרת את הרחבת האזור של immunoprecipitation כאשר המערכת מגיעה לשיווי משקל היווצרות מורכב בין אנטיגן לשדר הנוגדנים בתוך agarose. לעומת זאת, המצע של assay דיפוזיה microslide בתחילה הוא מתעכל על ידי מיקרוביאלית החלבון לשדר באזור מתקדם בקצב מזורז לתמס סביב הבאר. הקוטר גדל וההולך של האזור ממשיך עד האנזים מאבד פעילות או המצע הוא מותש. שיעור הייצור של האזור לתמס הוא התחיל להאיץ את הטוהר, ולכן הפעילות הספציפית, של האנזים או הריכוז של האנזים הוסיף לעליות היטב.

לקבלת כמותית להערכת הפעילות האנזימטית של antimicrobials חלבון נגד הרג חום B. subtilis, assay-שחרור לצבוע נבחר. מבחני Colorimetric באמצעות צבע R כחול מבריק Remazol (RBB) -labeled מצעים לאפשר הערכה צדדית ורגישה של פעילויותיו חלבון מיקרוביאליתty. הידרוליזה אנזימתי של תוצאות מצע שכותרתו RBB בשחרור מוצרים כחולים מסיסים שניתן למדוד בקלות על ידי ספקטרופוטומטר ב 595 ננומטר. כמה וריאציות של assay צבען שחרור RBB, פותח על מנת לאפיין אנזימים מיקרוביאלית חלבון אחרים, להראות את הגמישות של assay זה עבור יישום עם מצעים אחרים. לדוגמה, בקביעת ההשפעות של lysostaphin פעילות bacteriolytic, ג'ואו, et al., דיווחו על assay צבען שחרור באמצעות תאים staphylococcal צבוע RBB ו פפטידוגליקן staphylococcal כמו מצעים 12. בשנת שינוי של היישום של assay צבען שחרור RBB זה, מצע luteus Micrococcus RBB שכותרתו הוצע לשימוש כאמצעי מהיר ורגיש לאבחן מסך למחלות כגון זיהום חיידקים ואת הנוכחות של קרצינומה ממארת, אשר יכול להיות מתואמים ברמות הביטוי ליזוזים אדם בדם סרום 15. בנוסף, מצעי תא חיידק שכותרתו RBB ישסימפוני שמש שיטת zymogram לצורך זיהוי של ליזוזים 16.

אנו מדגימים את גבול גילוי וריד, נוחות, ואת השחזור של assay צבען השחרור, המאפשר הקרנת ספרייה מהירה לייצור אנזים. שינויים של assay לאפשר מבחני אפיון ביוכימי כמותית במורד הזרם, כולל השפעות בגין טמפרטורה, pH, ומליחות וכן את ההשפעות של אנזימים מפרקי חלבונים אחרים על פעילות חלבונים מיקרוביאלית 6. בנוסף, assay צבען שחרור כמותי שניתן להשתמש בהם כדי להשוות את פעילות האנזימים מרובים עבור מצע נתון. את assay צבען שחרור RBB דיווחה השירות עבור אנזימים עם פעילות נגד סוכרים בנוסף לאפיון וזיהוי של סוכני מיקרוביאלית חלבון. Pettersson ו אריקסון דיווחה על assay לאיתור פעילות endoglycanase באמצעות חרוזים פוליסכריד אמורפי, RBB צבוע של תאית, xylan, mannan, וצ'יטב 17. בשנת רחבה של ממצאים אלה, שיטה רגישה לגילוי של אנזימי chitinase המיוצרים על ידי Bacillus thuringiensis Bt-107 פותח באמצעות כיטין קולואידים שכותרתו עם RBB 18. ממחקרים אלה ואחרים, מקורות זמינים מסחרית של מצעים צבוע RBB צמחו לשימוש זיהוי של פעילות glycolytic, כולל אלה נגד קרטין, amylopectin, amylose, גליקוגן, laminarin, ד-xylan, גלוקן אזו-שעורה, ועמילן.

במחקר זה, אנו מדגימים את השירות של assay-שחרור לצבוע במתכונת microplate, צמצום נפח המצע שכותרתו RBB ואנזים הנדרש כדי להפיק את התוצאה colorimetric. כפי שמודגם באיור 4 ואיור 5, assay צבען שחרור microplate מספק גבול הגילוי נמוך assay דיפוזיה microslide לגילוי הפעילות האנזימטית. לגבי שימוש מהיר, שימור העבודה, וקלות הפרשנות, המיקרופוןassay דיפוזיה roslide מספק שירות מסכי תפוקה גבוהה ראשוניים עבור הנוכחות של פעילות מיקרוביאלית כמו גם האינדיקציה של נוכחות חלבון מיקרוביאלית בצעדי טיהור ובידוד חלבון במורד זרם. השילוב של מבחני שני אלה משלימים זה את זה את הסינון הראשוני ואפיון האולטימטיבי של antimicrobials חלבון הרומן

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was funded by The MITRE Corporation through the MITRE Innovation Program (Project 25MSR621-CA). The authors would like to thank Mark Maybury, Ph.D., Richard Games, Ph.D., James Patton, Ellen Mac Garrigle, Ph.D., Carl Picconatto, Ph.D., and Caroline Gary for their support and review of this work.

Materials

48-well flat-bottom microplate with low evaporation lid Becton Dickinson 3078
96-well flat-bottom microplate (Costar 3595) Corning, Inc. 3595
agarose Fisher Scientific BP162-100
α-chymotrypsin MP Biomedicals 215227205
Bacillus subtilis 168 American Type Culture Collection 23857
C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad
cork borer Humboldt H-9661
lysozyme Sigma-Aldrich L6876-1G
McFarland equivalence standard (2.0) Fisher Scientific R20412
microslides Fisher Scientific 22-38-103
nutrient broth Fisher Scientific S25959B
peptidoglycan of Bacillus subtilis 168 Sigma-Aldrich 69554-10MG-F
phosphate-buffered saline (1×) Teknova P0200
Pierce BCA Protein Assay Kit Life Technologies 23227
Synergy HT microplate spectrophotometer BioTek Instruments, Inc.
Remazol brilliant blue R dye (RBB) Sigma-Aldrich R8001
Salmonella enterica subsp. enterica American Type Culture Collection 10708
sodium azide Fisher Scientific S227-100
sodium hydroxide (NaOH) Fisher Scientific S318-500
Titer Tops pre-cut adhesive polyethylene film Diversified Biotechnology T-TOPS-50
UltraPure distilled water Invitrogen 10977-015
Name Company Catalog Number Comments
Solution
agarose solution
50 ml PBS
0.25 g agarose		 Add 10% sodium azide to the molten PBS/agarose solution
nutrient broth medium
4 g nutrient broth
500 ml Type I water
250mM sodium hydroxide (NaOH) solution
1 g NaOH
99 ml Type I water
200mM Remazol brilliant blue R dye (RBB)
1.25 g RBB
98.75 ml 250 mM NaOH solution
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anand, T. P., et al. Antimicrobial activity of marine bacteria associated with sponges from the waters off the coast of South East India. Microbiol Res. 161, 252-262 (2006).
  2. Tagg, J. R., Dajani, A. S., Wannamaker, L. W. Bacteriocins of gram-positive bacteria. Bacteriol Rev. 40, 722-756 (1976).
  3. Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat Rev Microbiol. 8, 15-25 (2010).
  4. Riley, M. A., Gordon, D. M. The ecological role of bacteriocins in bacterial competition. Trends Microbiol. 7, 129-133 (1999).
  5. Tenover, F. C. Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria. Am J Med. 119, S3-S10 (2006).
  6. Farris, M. H., Steinberg, A. D. Mitrecin A, an endolysin-like bacteriolytic enzyme from a newly isolated soil streptomycete. Lett Appl Microbiol. 58, 493-502 (2014).
  7. Dehart, H. P., Heath, H. E., Heath, L. S., Leblanc, P. A., Sloan, G. L. The Lysostaphin Endopeptidase Resistance Gene (epr) Specifies Modification of Peptidoglycan Cross Bridges in Staphylococcus simulans and Staphylococcus aureus. Appl Environ Microbiol. 61, 2811 (1995).
  8. Srivastava, K. K., Siddique, I. H. Quantitative chemical composition of peptidoglycan of Listeria monocytogenes. Infect Immun. 7, 700-703 (1973).
  9. Heilmann, H. D. On the peptidoglycan of the cell walls of Pseudomonas aeruginosa. Eur J Biochem. 31, 456-463 (1972).
  10. Schumann, P., Rainey, F., Oren, A. . Taxonomy of Prokaryotes. 38, (2011).
  11. Lachica, R. V., Genigeorgis, C., Hoeprich, P. D. Metachromatic agar-diffusion methods for detecting staphylococcal nuclease activity. Appl Microbiol. 21, 585-587 (1971).
  12. Zhou, R., Chen, S., Recsei, P. A dye release assay for determination of lysostaphin activity. Anal Biochem. 171, 141-144 (1988).
  13. Osserman, E. F., Lawlor, D. P. Serum and urinary lysozyme (muramidase) in monocytic and monomyelocytic leukemia. J Exp Med. 124, 921-952 (1966).
  14. Mancini, G., Carbonara, A. O., Heremans, J. F. Immunochemical quantitation of antigens by single radial immunodiffusion. Immunochemistry. 2, 235-254 (1965).
  15. Ito, Y., Yamada, H., Imoto, T. Colorimetric assay for lysozyme using Micrococcus luteus labeled with a blue dye, Remazol brilliant blue R, as a substrate. Chem Pharm Bull. (Tokyo). 40, 1523-1526 (1992).
  16. Hardt, M., Guo, Y., Henderson, G., Laine, R. A. Zymogram with Remazol brilliant blue-labeled Micrococcus lysodeikticus cells for the detection of lysozymes: example of a new lysozyme activity in Formosan termite defense secretions. Anal Biochem. 312, 73-76 (2003).
  17. Pettersson, B., Eriksson, K. E. A standardized spectrophotometric assay of endoglycanase activities using dyed, amorphous polysaccharides. Anal Biochem. 285, 220-224 (2000).
  18. Gomez Ramirez, M., Rojas Avelizapa, L. I., Rojas Avelizapa, N. G., Cruz Camarillo, R. Colloidal chitin stained with Remazol Brilliant Blue R, a useful substrate to select chitinolytic microorganisms and to evaluate chitinases. J Microbiol Methods. 56, 213-219 (2004).

Tags

Protein AntimicrobialsAntimicrobial ActivityMicroslide Diffusion AssayDye-release AssayBCA Protein AssayAgarose SolutionSodium AzideBacterial SubstrateMcFarland Turbidity StandardSerial DilutionBovine Serum AlbuminPositive Control

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials. J. Vis. Exp. (110), e53819, doi:10.3791/53819 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image