Summary

ניתוח<em> In vivo</em> נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

Published: April 29, 2016
doi:

Summary

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Abstract

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Introduction

בשנת יצורים רב-תאיים, נדידת תאים היא חיונית הן לפיתוח העובר שבו היא מבטיחה הארגון של תאים לתוך רקמות ואיברים, ובמשך חייו הבוגרים, בו היא לוקחת חלק הומאוסטזיס רקמות (ריפוי פצעים) וחסינות. בנוסף לפונקציות פיזיולוגיות אלה, נדידת תאים הוא מעורב גם במצבים פתולוגיים מגוונים, כולל, ובמיוחד, גרורות סרטניות.

נדידת תאים כבר נתחה במבחנה במשך עשרות שנים, מתן הבנה כוללת של המנגנונים המולקולריים הבטיחו תנועות תא על משטחים שטוחים. בשנת vivo עם זאת, תאים עומדים בפני סביבה מורכבת יותר. זה בבירור הופיע בשנים האחרונות כי הגירה בתוך אורגניזם עשויה להיות מושפעת רמזים חיצוניים כגון תאי מטריקס, תאי שכנים או כמוקינים מופרשים מנחת הגירה, וכי מנגנוני נהיגת נדידת תאים עשויים להשתנות ממה תוארה <em> במבחנה 1,2. המנגנונים הבטיחו נדידת תאי vivo קבלו פחות תשומת לב עד כה, בעיקר בשל הקושי הטכני גדל, לעומת במבחנה. בשנת vivo ניתוח נדידת תאים בפרט דורש גישה אופטית ישירה תאים נודדים, טכניקות לתייג תאים ייחודיים כדי לראות דינמיקה המורפולוגיה שלהם, כמו גם רווח או הפסד של הפונקציה מתקרב לבחון את התפקיד של גנים מועמדים. עד כה, רק כמה מערכות מודל מחסה מאפיינים אלה שימשו לנתח בתא vivo הגירה 3.

אנחנו לאחרונה השתמשנו ההגירה של צלחת prechordal הפוטנציאלית עוברות דג זברה מוקדם כמערכת מודל הנוח חדשה להעריך את הפונקציה של גני מועמדים בשליטת נדידת תאי vivo 4,5. צלחת prechordal פרוספקטיבי (הידוע גם בשם mesendoderm הקדמי) היא קבוצה של תאים ויוצרים בתחילת Gastrulation בצד הגבי של העובר. במהלך gastrulation בקבוצה זו נודד קולקטיבי כלפי קוטב החיה של העובר 6-8, כדי ליצור את צלחת prechordal, עיבוי mesendodermal, קדמית notochord: ומתחת הצלחת העצבית. החלק הקדמי של צלחת prechordal יהיה להצמיח בלוטת הבקיעה, בעוד החלק האחורי שלה תורם סביר לעמוד בראש mesoderm 9. הודות לפיתוח החיצוני בהירות אופטית של עובר הדג, נדידת תאים ניתן ישירות ובקלות שנצפתה המבנה הזה.

השתלת תאים היא טכניקה חזקה מאוד המאפשרת יצירה המהירה וקלה של עוברת פסיפס 10. הבעת סמני cytoskeletal פלורסנט בתוצאות תאים המושתלים בתוך התיוג של תאים בודדים, המורפולוגיה והדינמיקה של אשר ניתן להבחין בקלות. שילוב זה רווח או הפסד של הפונקציה מתקרב היתרי ניתוח של פונקציות אוטונומיות התא של פחיתגן didate.

הפרוטוקול המובא מתאר כיצד אנו הערכנו את הפונקציה של Sin1 רכיב TORC2 בשליטת דינמיקת גירה תקטין תא in vivo 5. אבל, כאמור בתוצאות ודנו עוד יותר, זה יכול לשמש כדי לנתח את המשמעות הפוטנציאל של כל גן מועמד בשליטת נדידת תאי in vivo.

Protocol

הערה: איור 1 מציג את קווי המתאר של הפרוטוקול. 1. הכנה של מחטי הזרקה והשתלות הערה: מחטים ניתן להכין בכל עת ומאוחסנים. שמור אותם בצלחת פטרי, על להקה של פלסטלינה. חותם את המנה עם parafilm כדי להג?…

Representative Results

הטכניקה הציגה שמשה לנתח את התפקיד של Sin1, אחד מרכיבי הליבה של הטור 2 המורכב (TORC2), בשליטת נדידת תאי vivo. שימוש השתלת תאים מתיר תיוג של תאים מבודדים וניתוח של תופעות תאים אוטונומיים. סרט S1 מציג את ההגירה של ובתאים צלחת prechordal המושתלים. תיוג יקטין ע…

Discussion

פרוטוקול זה מציג דרך קלה ללמוד את התפקיד של גן מועמד נדידת תאי in vivo, על ידי שילוב של היצירה עוברת chimeric באמצעות השתלה תאית עם הדמיה לחיות.

יצירה עוברת פסיפס

לימוד הדינמיקה של תא דורש הדמיה ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank F. Bouallague and the IBENS animal facility for excellent zebrafish care. Research reported in this publication was supported by the Fondation ARC pour la recherche sur le cancer, grants N° SFI20111203770 and N° PJA 20131200143.

Materials

Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm) Harvard Apparatus 300085 standard thickness
Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm) Harvard Apparatus 300085 thin-walled
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml
fine tweezers Dumont Fine Science Tools 11254-20 5F
glass bottom dishes MatTek P35G-0-10-C
Air transjector Eppendorf 5246
Micro-forge Narishige MF-900
Microgrinder Narishige EG-44
Micromanipulator (for injection) Narishige MN-151
Micromanipulator (for cell transplantation) Leica Leica Micromanipulator
Hammilton Syringe Narishige IM-9B
Micropipette puller David Kopf Instruments Model 720
Transplantation mold Adapative Science Tools PT-1
Needle holder Narishige HI-7
Tube connector Narishige CI-1
PTFE tubing Narishige CT-1

References

  1. Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 813-824 (2014).
  2. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model. Journal of Cell Biology. 188 (1), 11-19 (2010).
  3. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature reviews. Molecular cell biology. 10 (7), 445-457 (2009).
  4. Dang, I., Gorelik, R., et al. Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration. Nature. , (2013).
  5. Dumortier, J. G., David, N. B. The TORC2 Component, Sin1, Controls Migration of Anterior Mesendoderm during Zebrafish Gastrulation. Plos One. 10, e0118474 (2015).
  6. Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish. BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).
  7. Ulrich, F., Concha, M. L., et al. Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation. Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).
  8. Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 1-6 (2012).
  9. Gritsman, K., Talbot, W. S., Schier, A. F. Nodal signaling patterns the organizer. Development. 127 (5), 921-932 (2000).
  10. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of visualized experiments : JoVE. (29), (2009).
  11. Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
  12. Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
  13. Gorelik, R., Gautreau, A. Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration. Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).
  14. Sacan, A., Ferhatosmanoglu, H., Coskun, H. CellTrack: An open-source software for cell tracking and motility analysis. Bioinformatics. 24 (14), 1647-1649 (2008).
  15. Tahinci, E., Symes, K. Distinct functions of Rho and Rac are required for convergent extension during Xenopus gastrulation. Developmental biology. 259 (2), 318-335 (2003).
  16. Zhang, T., Yin, C., et al. Stat3-Efemp2a modulates the fibrillar matrix for cohesive movement of prechordal plate progenitors. Development. 141 (22), 4332-4342 (2014).
  17. Riedl, J., Crevenna, A. H., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  18. Burkel, B. M., Von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (11), 822-832 (2007).
  19. Yoo, S. K., Deng, Q., Cavnar, P. J., Wu, Y. I., Hahn, K. M., Huttenlocher, A. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Developmental cell. 18 (2), 226-236 (2010).
  20. Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental biology. 393 (2), 209-226 (2014).
  21. Johnson, H. W., Schell, M. J. Neuronal IP3 3-kinase is an F-actin-bundling protein: role in dendritic targeting and regulation of spine morphology. Molecular biology of the Cell. 20 (24), 5166-5180 (2009).
  22. Yi, J., Wu, X. S., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).

Play Video

Cite This Article
Giger, F. A., Dumortier, J. G., David, N. B. Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (110), e53792, doi:10.3791/53792 (2016).

View Video