Analyzing<em> In Vivo</em> Zellmigration unter Verwendung von Zelltransplantationen und Zeitraffer-Imaging in Zebrafischembryonen
Summary
Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.
Abstract
Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.
Introduction
In vielzelligen Organismen, ist die Zellmigration wesentlich sowohl für die Entwicklung des Embryos, wo sie die Organisation von Zellen in Geweben und Organen, und für das Erwachsenenleben gewährleistet, wo es Teil Gewebshomöostase (Wundheilung) und Immunität nimmt. Neben diesen physiologischen Funktionen, ist die Zellmigration in verschiedenen pathologischen Situationen beteiligt, einschließlich, insbesondere Krebsmetastasen.
Die Zellmigration ist seit Jahrzehnten in vitro untersucht, ein umfassendes Verständnis der molekularen Mechanismen , die Bereitstellung zu gewährleisten Zellbewegungen auf ebenen Flächen. In vivo jedoch Zellen werden durch eine komplexere Umgebung konfrontiert. Es ist deutlich in den vergangenen Jahren zeigte sich, dass die Migration innerhalb eines Organismus kann durch externe Signale, wie beispielsweise die extrazelluläre Matrix beeinflusst werden, Zellen oder sezernierte Chemokine benachbarten Migration führen, und dass die Mechanismen der Zellmigration Antriebs von variieren, was beschrieben wurde <em> in vitro 1,2. Die Mechanismen in vivo Zellmigration sichergestellt haben weniger Aufmerksamkeit bisher, vor allem wegen der erhöhten technischen Schwierigkeit, im Vergleich zu in – vitro – Untersuchungen. In vivo – Analyse der Zellmigration insbesondere migrierenden Zellen direkten optischen Zugang erfordert, Techniken einzigartige Zellen zu markieren in um ihre Dynamik und Morphologie sowie Gewinn oder Verlust der Funktion zu sehen, nähert sich die Rolle der Kandidatengene zu testen. Bisher sind nur wenige Modellsysteme diese Merkmale beherbergen wurden 3 verwendete in vivo Zellmigration zu sezieren.
Wir haben vor kurzem die Migration der prospektiven Prächordalplatte in frühen Genaktivität als neues praktisches System – Modell bei der Kontrolle der in vivo Zellmigration 4,5 die Funktion der Kandidaten – Gene zu untersuchen. Prospective Prächordalplatte (auch als vordere mesendoderm bekannt) ist eine Gruppe von Zellen bei Beginn der gast bildenrulation auf der dorsalen Seite des Embryos. Während der Gastrulation wandert diese Gruppe kollektiv gegenüber dem Tier Pol des Embryos 6-8, die Prächordalplatte zu bilden, eine mesendodermal Verdickung, anterior der Chorda und die neurale Platte zugrunde liegt. Der vordere Teil der Prächordalplatte führen zur Schraffur Drüse geben, während sein hinterer Teil trägt wahrscheinlich Mesoderm 9 Kopf. Dank der externen Entwicklung und optische Klarheit des Fischembryo, Zellmigration unmittelbar werden kann und leicht in dieser Struktur beobachtet.
Zelltransplantation ist eine sehr potente Technik , die 10 für die schnelle und einfache Erstellung von Mosaik-Embryonen erlaubt. Exprimieren fluoreszierenden Marker Zytoskelett in transplantierten Zellen führt zur Markierung von isolierten Zellen kann die Morphologie und die Dynamik, die leicht beobachtet werden. dies zu einem Verlust oder Gewinn von Funktions Kombination Ansätze ermöglicht die Analyse von Zell-autonome Funktionen einer Dosetritts Gen.
Das dargestellte Protokoll beschreibt , wie wir die Funktion des TORC2 Komponente Sin1 in Steuerung der Zellmigration und Aktindynamik in vivo 5 beurteilt. Aber, wie in den Ergebnissen genannten und weiter diskutiert, könnte es verwendet werden , um die potentiellen Auswirkungen jeder Kandidatengens Migration in Steuern Zelle in vivo zu analysieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll stellt eine einfache Möglichkeit , die Rolle eines Kandidaten – Gen in die Zellmigration in vivo zu untersuchen, durch die Schaffung von Chimären – Embryonen Kombination Zelltransplantation mit Live – Bildgebung.
Erstellung von Mosaik-Embryonen
Untersuchung der Dynamik einer Zelle erfordert die Visualisierung seiner Kontur zytoplasmatischen Erweiterungen zu analysieren. oder anders bezeichnet – – Dies kann durch Markierung isolierten Z…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank F. Bouallague and the IBENS animal facility for excellent zebrafish care. Research reported in this publication was supported by the Fondation ARC pour la recherche sur le cancer, grants N° SFI20111203770 and N° PJA 20131200143.
Materials
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | standard thickness |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | thin-walled |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml |
| fine tweezers | Dumont Fine Science Tools | 11254-20 | 5F |
| glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Air transjector | Eppendorf | 5246 | |
| Micro-forge | Narishige | MF-900 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Micromanipulator (for injection) | Narishige | MN-151 | |
| Micromanipulator (for cell transplantation) | Leica | Leica Micromanipulator | |
| Hammilton Syringe | Narishige | IM-9B | |
| Micropipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Transplantation mold | Adapative Science Tools | PT-1 | |
| Needle holder | Narishige | HI-7 | |
| Tube connector | Narishige | CI-1 | |
| PTFE tubing | Narishige | CT-1 |
References
- Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 813-824 (2014).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model. Journal of Cell Biology. 188 (1), 11-19 (2010).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature reviews. Molecular cell biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Dang, I., Gorelik, R., et al. Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration. Nature. , (2013).
- Dumortier, J. G., David, N. B. The TORC2 Component, Sin1, Controls Migration of Anterior Mesendoderm during Zebrafish Gastrulation. Plos One. 10, e0118474 (2015).
- Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish. BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).
- Ulrich, F., Concha, M. L., et al. Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation. Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).
- Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 1-6 (2012).
- Gritsman, K., Talbot, W. S., Schier, A. F. Nodal signaling patterns the organizer. Development. 127 (5), 921-932 (2000).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of visualized experiments : JoVE. (29), (2009).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
- Gorelik, R., Gautreau, A. Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration. Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).
- Sacan, A., Ferhatosmanoglu, H., Coskun, H. CellTrack: An open-source software for cell tracking and motility analysis. Bioinformatics. 24 (14), 1647-1649 (2008).
- Tahinci, E., Symes, K. Distinct functions of Rho and Rac are required for convergent extension during Xenopus gastrulation. Developmental biology. 259 (2), 318-335 (2003).
- Zhang, T., Yin, C., et al. Stat3-Efemp2a modulates the fibrillar matrix for cohesive movement of prechordal plate progenitors. Development. 141 (22), 4332-4342 (2014).
- Riedl, J., Crevenna, A. H., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Burkel, B. M., Von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (11), 822-832 (2007).
- Yoo, S. K., Deng, Q., Cavnar, P. J., Wu, Y. I., Hahn, K. M., Huttenlocher, A. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Developmental cell. 18 (2), 226-236 (2010).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental biology. 393 (2), 209-226 (2014).
- Johnson, H. W., Schell, M. J. Neuronal IP3 3-kinase is an F-actin-bundling protein: role in dendritic targeting and regulation of spine morphology. Molecular biology of the Cell. 20 (24), 5166-5180 (2009).
- Yi, J., Wu, X. S., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
