تحليل<em> في فيفو</em> الهجرة الخلية باستخدام الزرع خلية والتصوير الوقت الفاصل في الزرد الأجنة
Summary
Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.
Abstract
Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.
Introduction
في الكائنات متعددة الخلايا، والهجرة الخلية الأساسية سواء بالنسبة للتطور الجنين حيث أنه يضمن تنظيم الخلايا في الأنسجة والأعضاء، ولحياة البالغين، حيث يشارك في توازن الأنسجة (التئام الجروح) والحصانة. وبالإضافة إلى هذه الوظائف الفسيولوجية، والهجرة الخلية هي أيضا متورطة في حالات المرضية المختلفة، بما في ذلك، على وجه الخصوص، الانبثاث السرطان.
وقد تم تحليل هجرة الخلايا في المختبر لعقود من الزمن، وتوفير فهم شامل من الآليات الجزيئية ضمان الحركات خلية على الأسطح المستوية. في الجسم الحي ومع ذلك، تواجه الخلايا عن طريق بيئة أكثر تعقيدا. ويبدو واضحا في السنوات الماضية أن الهجرة داخل كائن حي قد يتأثر بعوامل خارجية مثل المصفوفة خارج الخلية، وخلايا أو كيموكينات يفرز الهجرة توجيه المجاورة، وأن آليات القيادة الهجرة الخلية قد تختلف من ما تم وصفه <em> في المختبر 1،2. وقد تلقى آليات ضمان في هجرة الخلايا المجراة اهتماما أقل حتى الآن، وذلك أساسا بسبب صعوبة التقنية وزيادة، مقارنة مع الدراسات في المختبر وفي الجسم الحي يتطلب تحليل هجرة الخلايا على وجه الخصوص وصول البصرية مباشرة إلى الخلايا المهاجرة، وتقنيات لتسمية الخلايا فريدة من نوعها في لمعرفة ديناميتها والتشكل، وكذلك ربح أو خسارة وظيفة النهج لاختبار دور الجينات المرشحة. حتى الآن، وقد استخدمت سوى عدد قليل من النظم نموذج إيواء هذه الخصائص لتشريح الجسم الحي في خلية الهجرة 3.
كنا مؤخرا هجرة لوحة القردودية المقدمة المحتملين في الأجنة الزرد الأولى كنظام نموذج مناسب الجديد لتقييم وظيفة الجينات مرشح في السيطرة في الجسم الحي خلية الهجرة 4،5. لوحة القردودية المقدمة المحتملين (المعروف أيضا باسم mesendoderm الأمامي) هي مجموعة من الخلايا التي تشكل في بداية جاستrulation على الجانب الظهري للجنين. خلال المعيدة هذه المجموعة تهاجر بشكل جماعي نحو القطب الحيواني من الجنين 6-8، لتشكل لوحة القردودية المقدمة، سماكة mesendodermal، الأمامي إلى الحبل الظهري، والكامنة لوحة العصبية. والجزء الأمامي من لوحة القردودية المقدمة تؤدي إلى الغدة الفقس، بينما الجزء الخلفي لها من المرجح أن يساهم لرئاسة الأديم المتوسط 9. بفضل التطور الخارجية والوضوح البصري للجنين الأسماك وهجرة الخلايا ويمكن ملاحظة مباشرة وبسهولة في هذا الهيكل.
زرع الخلايا هي تقنية قوية جدا التي تسمح لخلق السريع والسهل للأجنة الفسيفساء 10. معربا عن علامات هيكل الخلية الفلورسنت في الخلايا المزروعة النتائج في وضع العلامات على الخلايا المعزولة، والتشكل وديناميكية والتي يمكن ملاحظتها بسهولة. الجمع بين هذا إلى الخسارة أو الربح من وظيفة النهج تصاريح تحليل وظائف خلايا مستقلة من علبةالجينات didate.
يصف بروتوكول المعروضة كيف يمكننا تقييم وظيفة Sin1 عنصر TORC2 في السيطرة على الهجرة الخلية وأكتين ديناميكية في الجسم الحي 5. ولكن، كما هو مذكور في النتائج ومناقشتها أبعد من ذلك، يمكن استخدامها لتحليل الآثار المحتملة من أي الجينات مرشح في السيطرة على الهجرة خلية في الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويعرض هذا البروتوكول وسيلة سهلة لدراسة دور الجينات مرشح في الهجرة خلية في الجسم الحي، من خلال الجمع بين خلق أجنة خيالية باستخدام زراعة الخلايا مع التصوير الحي.
خلق الأجنة الفسيفساء
دراس…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank F. Bouallague and the IBENS animal facility for excellent zebrafish care. Research reported in this publication was supported by the Fondation ARC pour la recherche sur le cancer, grants N° SFI20111203770 and N° PJA 20131200143.
Materials
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | standard thickness |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | thin-walled |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml |
| fine tweezers | Dumont Fine Science Tools | 11254-20 | 5F |
| glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Air transjector | Eppendorf | 5246 | |
| Micro-forge | Narishige | MF-900 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Micromanipulator (for injection) | Narishige | MN-151 | |
| Micromanipulator (for cell transplantation) | Leica | Leica Micromanipulator | |
| Hammilton Syringe | Narishige | IM-9B | |
| Micropipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Transplantation mold | Adapative Science Tools | PT-1 | |
| Needle holder | Narishige | HI-7 | |
| Tube connector | Narishige | CI-1 | |
| PTFE tubing | Narishige | CT-1 |
References
- Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 813-824 (2014).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model. Journal of Cell Biology. 188 (1), 11-19 (2010).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature reviews. Molecular cell biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Dang, I., Gorelik, R., et al. Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration. Nature. , (2013).
- Dumortier, J. G., David, N. B. The TORC2 Component, Sin1, Controls Migration of Anterior Mesendoderm during Zebrafish Gastrulation. Plos One. 10, e0118474 (2015).
- Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish. BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).
- Ulrich, F., Concha, M. L., et al. Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation. Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).
- Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 1-6 (2012).
- Gritsman, K., Talbot, W. S., Schier, A. F. Nodal signaling patterns the organizer. Development. 127 (5), 921-932 (2000).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of visualized experiments : JoVE. (29), (2009).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
- Gorelik, R., Gautreau, A. Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration. Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).
- Sacan, A., Ferhatosmanoglu, H., Coskun, H. CellTrack: An open-source software for cell tracking and motility analysis. Bioinformatics. 24 (14), 1647-1649 (2008).
- Tahinci, E., Symes, K. Distinct functions of Rho and Rac are required for convergent extension during Xenopus gastrulation. Developmental biology. 259 (2), 318-335 (2003).
- Zhang, T., Yin, C., et al. Stat3-Efemp2a modulates the fibrillar matrix for cohesive movement of prechordal plate progenitors. Development. 141 (22), 4332-4342 (2014).
- Riedl, J., Crevenna, A. H., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Burkel, B. M., Von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (11), 822-832 (2007).
- Yoo, S. K., Deng, Q., Cavnar, P. J., Wu, Y. I., Hahn, K. M., Huttenlocher, A. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Developmental cell. 18 (2), 226-236 (2010).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental biology. 393 (2), 209-226 (2014).
- Johnson, H. W., Schell, M. J. Neuronal IP3 3-kinase is an F-actin-bundling protein: role in dendritic targeting and regulation of spine morphology. Molecular biology of the Cell. 20 (24), 5166-5180 (2009).
- Yi, J., Wu, X. S., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
