SPRi、ナノのSPRiおよびELISAアッセイを用いて血清中のヒト成長ホルモンの比較分析

SPRiとナノのSPRi（NanoEnhancersを採用するのSPRi）の性能は、複雑な環境でのrhGHの検出のためのELISA法と比較しました。これらの方法の設定の違いは、ここで簡単に説明します。 SPRi（直接検出、 図1）については、捕捉抗体は、表面上に固定化され、次いでサンプルを注入し、センサー表面への検体の結合のリアルタイムおよびラベルフリーの方法で直接測定されます。分析物がセンサー表面に結合した後、しかし、ナノのSPRi（ 図1）を用いて、連続した噴射がのSPRi信号を増幅するために、検出抗体で被覆された量子ドットと続きます。 図1のCでのrhGHの検出のダイレクトモード（のSPRi）を比較略図及び増幅モード（ナノのSPRi）失礼なサンプル。リガンド（rhGHをまたはIgG特異的抗体）がのSPRiのバイオチップ上のアレイ形式で固定化しました。標的タンパク質（rhGHの）はセンサ表面に導入されたヒト血清中にスパイク直接（のSPRi）を検出し、順次NanoEnhancers（ナノのSPRi）と強調した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 ELISAに関しては、マルチウェルプレートは、既に捕捉抗体で予め官能到着すると、サンプルを導入し、目的の分析物が結合します。検出抗体は、基質を加え、続いて導入されます。光学密度は、その後、450nmで測定されます。本研究では、市販のELISAキット（図2）のrhGHを10％ヒト血清にスパイクを測定するために使用しました。 8 / 53508fig2.jpg "/> 図2 ELISAアッセイ手順の略図 。 rhGHタンパク質（青楕円）のrhGHのに特異的なモノクローナル抗体（黄）で予め官能化されているウェルに導入されます。非特異的相互作用は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP、紫）でprefunctionalized検出抗体を導入し、続いて洗浄緩衝液でウェルを洗浄することによって除去されます。解決策は、基質テトラメチルベンジジン（TMB、金）を追加した後の色に変化します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図3は、のrhGHの滴定曲線は、10％ヒト血清にスパイクし、450 nmで得たODに対してプロットされている表します。良好な線形応答が観察され、検出限界は、1 ngの/ mlであると決定されました。 VARの係数iation（CV）は、良好な再現性を示唆して6.5％でした。 図3. ELISAデータ分析。血清中にスパイクのrhGHの濃度は、450nmで得られたODに対してプロットされている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 次に、ヒト血清中にスパイクしたrhGHの検出のSPRiで評価しました。 rhGHの直接検出は、対応する濃度勾配曲線（ 図4）で得られた、各点は、各濃度について3のSPRi動態曲線から計算した反射率差の平均値を表します。検出限界（LOD）は、3.61 ng / mlであると決定されました。 SPRi直接検出アッセイは、アッセイのCVとして非常に再現性がありました唯一の4.1％でした。 hGHの図4.直接のSPRi検出を、10％ヒト血清中にスパイクした。hGHの様々な量を注入した後、得られた正規化のSPRi運動プロットが高塩緩衝液の注入（垂直破線）は、非除去するための、ヒトの血清中にスパイク固有の相互作用。 hGHの様々な量の結合を表す濃度勾配曲線は、ビオチン化hGHの固有-抗体でprefunctionalizedされたセンサ表面にヒト血清にスパイクした。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 SPRiバイオセンサの感度を高めるために、NanoEnhancersは（量子ドットは、検出抗体で予備官能化）に順次ヒト血清中スパイクのrhGHの存在を強調するためにセンサ表面にtroduced。 。の関心イメージングの制御された領域上に図5、バックグラウンド減算した後、NanoEnhancersは、最小限の信号変化（免疫グロブリンG（IgG）特異的抗体、反射率0.38％の変化で、しかし、7.9％までのバイオセンサーの応答を増幅することができましたセンサー表面は、rhGHの特異的抗体を持っている興味のある領域のみが経験に運動センサーの応答を直接裏付ける最大のコントラスト変化を固定化したことを明らかにしました。 図5.事前にサンドイッチアッセイを10％ヒト血清にスパイクした。のSPRi動態プロットバッファー中のrhGH（30 ngの/ ml）を注射した後（10mMのPBS、150mM塩化ナトリウム、pH値= 7.4）を用いたrhGHの検出 11メルカプトウンデカン酸/ rhGH-と-functionalizedチップ特異的抗体、その後、検出抗体でコーティングされた量子ドット（NanoEnhancers）を加え、続いて、BSAでブロックしたIgG抗体を制御する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 ナノのSPRiバイオセンサーの実用性を実証するために、粗製サンプル中のrhGHの測定範囲を評価しました。 0.25 PG / mlの3万PG /から拡張作業範囲はNanoEnhancers（ 図6）の添加に応答として得られました。これは、滴定曲線上の各点は、3つの独立した実験から平均化されることは注目に値します。したがって、検出の下限は9.20 pg / mlであることが算出され、変動係数は20％でした。 図6。hGHのナノのSPRiの検出は、ヒト血清中にスパイクされたヒト血清サンプルについてhGH_specific_Anti、量子ドット、増幅された信号の正規化のSPRi動態プロット表現はhGHの異なる濃度でスパイクしました。 （灰色の）垂直の破線は、ランニング緩衝液の注入点を表します。 （b）は、hGHの様々な量の注入後NanoEnhancers（hGH_specific_Anti、量子ドット）の結合を示す濃度勾配曲線11メルカプトウンデカン酸/ hGHを特異的抗体でprefunctionalizedされたセンサー表面にヒト血清にスパイクした。 クリックしてくださいここで、この図の拡大版を表示します。 次に、濃度の関数としてのSPR反射率曲線で発生する変更は、直接およびNanoEnhancerバイオアッセイ法（ 図7）との間で比較しました。直接デについて25および0.25 pg / mlでの間tection技法は、信号が平坦域に開始し、これらの濃度が3 ng / mlで（ 図7）のLODを下回るように、これは驚くべきことではありません。同様に、増幅された技術のために、9.2 pg / mlで信号のLOD以下の濃度は、高原に開始され、実質的に全く変化を示さありませんでした。 rhGHの導入は30,000ヒト血清中NanoEnhancersの注入に続いて（直接検出）（増幅された検出）をスパイクした後、 図7ナノのSPRiでのSPRiの比較分析。この棒グラフは、反射率の変化率（％R）を示しますpg / mlで、2.5 pg / mlで250 pg / mlで、25 pg / mlであり、0.25 pg / mlで。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1">さらに、ナノのSPRiバイオセンサの特異性を評価しました。インスリン様成長因子-1（IGF-1）は、hGHが肝細胞膜上の成長ホルモン受容体を介してIGF-1の分泌を刺激するための対照として注射したヒト血清にスパイク。 IGF-1血清中の注入後、NanoEnhancersを順次注入し、SPRシグナル応答は、任意の特異的結合（ 図8）を示さありませんでした。血清試料中のスパイクのrhGHのrhGHが抗体で官能全く同じ場所に注入されたときしかし、シグナル増強が観察されました。結論として、ナノのSPRiプラットフォームは、rhGHのための優れた特異性と選択性を示しました。 図8のrhGHに向けてナノのSPRi選択性の評価。s内のrhGH（黒）およびIGF-1（赤）の注射後のナノのSPRiバイオセンサーの応答先のとがった血清。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 相関分析のSPRiは、信号強度およびELISAの光学密度の値（ 図9）との間の相関を決定するために、ピアソンの相関係数を用いて行きました。 p値<0.01を有意とみなしました。このグラフに示されるように、のSPRiおよびELISAによって測定スパイクヒト血清中のrhGHレベルの間に良好な相関があります。 r値は、9種類の試料について0.9263でした。 ELISA及びナノのSPRi間に 図9 ピアソン相関分析。プロットは、ELISA光学濃度（x軸）の値を持つナノのSPRi信号強度（y軸）を相関させます。 （梨相関係数のn = 9、R = 0.9263、P = 0.00000183）に。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 平衡解離定数（K D）は、ELISA用のGraphPadソフトウェアを用いて決定しました。計算されたK D値は、約79 nMであった（表3）。 （Kのa）のオンとオフ（K d）は速度をELISAによって決定することができませんでした。しかし、データ分析ソフトウェアを使用して、直接検出方法は、1つのrhGH分子に相当する22キロダルトンの分子量を用いて、23ピコモルのK D値となりました。オンとオフ率は、それぞれ6.1×10 7 M -1 s -1の1.33×10 -3 秒 -1であると計算されました。これは本質的に変換し、第2あたりのrhGHおよび抗体複合体崩壊の0.13％。 AについてmplifiedのSPRi実験、より強力な全体的な相互作用を計算した結合親和性としてNanoEnhancersとのrhGHの間で観察されたが4.3 pMであると決定しました。また、強​​力な会合速度が捕捉抗体よりNanoEnhancersとのrhGHのために観察された/ rhGHを、しかし解離速度が示唆毎秒NanoEnhancer /のrhGH /捕捉抗体崩壊の0.26パーセント。 方法 K D（アフィニティ） K（オン率） （オフレート） の K d LOD ELISA 79.45×10 -9 M NA NA 1 ngの/ mlの SPRi 23.2×10 -12 M 6.1×10 7 M -1 秒 -1 <td> 1.33×10 -3 秒 -1 3.61 ng / mlでナノのSPRi 4.33×10 -12 M 7.54×10 8 M -1 秒 -1 2.62×10 -3 秒 -1 0.0092 ng / mlで 表3.全動態データ解析。親和性の評価、レートオンとオフ率グラフパッド（ELISA）およびデータ解析（のSPRiとナノのSPRi）ソフトウェアを用いて抗体応答の。 1のrhGH分子に対応する22キロダルトンの分子量を用いて、結合活性の決意を選択しました。検出限界は、Excelを使用して、すべての3つの研究のために決定しました。