Сравнительный анализ человеческого гормона роста в сыворотке, используя SPRI, Nano-SPRI и ELISA Анализы
Summary
Предлагаемая работа оценивает диагностические возможности прямого и усиленного поверхностного плазмонного резонанса (SPRI) анализы, в частности, для обнаружения рекомбинантного человеческого гормона роста в шипами человеческой сыворотки, путем сравнения SPRI приводит непосредственно коммерчески доступный иммуноферментного анализа (ИФА) Комплект.
Abstract
Чувствительность и селективность методы обнаружения гормона роста человека (HGH) в широком диапазоне концентраций (высокие уровни 50-100 нг мл – 1 и минимальные уровни 0,03 нг мл – 1) в циркулирующей крови необходимы как переменные уровни могут указывают изменены физиологию. Например, нарушения роста, происходящие в детском возрасте может быть диагностирована путем измерения уровней гормона роста в крови. Кроме того, злоупотребление рекомбинантного гормона роста в спорте не только ставит этический вопрос он также представляет серьезную угрозу для здоровья обидчика. Один из популярных стратегия для измерения чГР неправильного использования, основан на измерении соотношения 22 кДа гормон роста общего ГР, как не 22 кДа эндогенные уровни падение после экзогенного рекомбинантного чГР (рчГР) администрации. Поверхностного плазмонного резонанса (SPRI) является аналитическим инструментом, который позволяет напрямую (без наклеек) мониторинг и визуализацию биомолекулярных взаимодействий путем записи изменений рефракции экзэкс рядом с поверхностью датчика в режиме реального времени. В противоположность этому, наиболее часто используемый колориметрический метод, иммуноферментный анализ (ИФА) использует антитела, меченые ферментами обнаружения для косвенного измерения концентрации анализируемого вещества после добавления субстрата, что вызывает изменение цвета. Для повышения чувствительности обнаружения, усиливаются SPRI использует формат сэндвич-анализ и ближнего инфракрасного квантовые точки (КТ), чтобы увеличить силу сигнала. После непосредственного обнаружения SPRI рекомбинантного рчГР в шипами человеческой сыворотки, сигнал SPRI усиливается последовательного впрыска детектирующего антитела с покрытием ближней инфракрасной КТ (Нано-SPRI). В этом исследовании, была оценена диагностическая потенциал прямого и усиленного SPRI для измерения рчГР шипами в сыворотке человека и напрямую сравнивать с возможностями имеющегося в продаже ELISA набора.
Introduction
Гормон роста человека (HGH) представляет собой пептидный кислоты 191 амино (22 кДа), полученный в гипофизе и непосредственно попадают в кровь. Взаимодействие между гипоталамо роста пептидного гормона-рилизинг гормона (GHRH) и соматотропина вызвать пульсирующие выделениями ГР. В результате уровень гормона роста варьируются от максимумов в 50-100 нг / мл до минимума в диапазоне 0,03 нг / мл 1. Дефицит или избыток чГР в организме может вызвать широкий спектр физиологических симптомов аномальные. Например, превышение уровней гормона роста может привести к гигантомании 2 и 3 диабета. Истощенные уровни гормона роста вызывает низкий уровень сахара в крови у новорожденных и слабый плотность костной ткани и депрессии у взрослых 4.
Администрация рекомбинантной форме гормона роста (рчГР) улучшает мышечную массу при снижении жира. Таким образом, это вещество стало наркотиком для профессиональных и любительских спортсменов, поскольку это улучшает физическую силу, что наделяет ADVantage в спортивных соревнованиях. рчГР запрещено Всемирным антидопинговым агентством (ВАДА) 5,6 и особых усилий международных исследователей было сосредоточено на разработке тестов, которые могут обнаружить свое присутствие или анаболический эффект.
Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), был предпочтительным методом для определения гормона роста в крови 7 всего. Хотя, ИФА является надежным методом предлагая хорошую чувствительность и селективность, сравнительно много времени и трудоемким. Кроме того, ИФА основан на косвенном обнаружении чГР с использованием ферментативных меток. В противоположность этому, поверхностный плазмонный резонанс (SPR) позволяет обнаруживать чГР непосредственно без использования меток в реальном времени. Принцип обнаружения за SPR включает в себя чувствительный поверхность, состоящую из призмы, покрытого тонким слоем металла (золота или серебра); когда монохромные поляризованный свет взаимодействует с поверхностью металла, "поверхностные плазмоны" генерируются. Связывание аналитас рецептором поверхности с иммобилизованным на поверхности металла возмущает условия резонанса, приводящие к смещенной резонансной падения, которые затем могут быть соотнесены с концентрацией анализируемого вещества. Биосенсоры SPR основе теперь коммерчески доступны, которые предлагают в режиме реального времени, метки, свободное технику для мониторинга биомолекулярные связывания событий и биохимические реакции 8-10. Совсем недавно, SPRI была разработана в ответ на потребность в мультиплексирования (т.е., мониторинг нескольких обязательных мероприятий одновременно), чего не было возможно в классической биосенсоров СРП. Таким образом, SPRI возник как инструмент для мониторинга несколько обязательных мероприятий одновременно. Современные системы SPRI основаны на микроскопических изображений поверхности, возбуждаемого светом под определенным углом и длиной волны 10. Затем изображение захватили на зарядовой связью (ПЗС) массива.
На сегодняшний день, было несколько анализы SPR основе, разработанные для выявления чГР 11-14. Один частности стратегия, Известный как метод изоформы 15, основан на измерении соотношения 22 кДа гормон роста общего чГР, как не 22-кДа эндогенные уровни упасть после экзогенного рчГР. Недавно De Juan-франко др. 11 сообщили о разработке иммуносенсора SPR основе для селективного детектирования 22 кДа и 20 кДа чГР изоформ в образцах сыворотки человека. Моноклональные антитела, специфичные к каждой изоформы были иммобилизованы непосредственно на датчике золота, позволяющего измерять как изоформ одновременно в виде одной инъекции с пределом обнаружения в 0,9 нг мл -1. В качестве альтернативы, SPR был использован для скрининга антител с высокой специфичностью к ГР 13. Если концентрация анализируемого вещества-мишени падает ниже предела системы SPRI в обнаружении (<нМ), приходится прибегать к усиления сигнала с помощью SPRI использования наночастиц (нано-SPRI). Такое усиление SPR основе были хорошо документированы в литературе 16-19 для Various типы аналита и поверхностей.
В этой работе, была исследована аналитическая потенциал биосенсоров на основе SPRI и нано-SPRI, в частности, для обнаружения рчГР в шипами человеческой сыворотки, и сравнение его способности обнаружения непосредственно в ELISA. Следующие параметры будут рассмотрены и учтены: времени обнаружения, чувствительность, кинетическая профиль, воспроизводимость и специфичность.
Protocol
Representative Results
Discussion
Нерегулярные уровни гормона роста, естественным гормоном, были связаны с многочисленными медицинских расстройств, которые влияют на человеческий рост и развитие. Кроме того, введение экзогенного рчГР обычно используется спортсменами, хотя это запрещено, в качестве легирующего агента для повышения их эффективности. Проблемы обнаружения рчГР результат неправильного использования из-за трудностей в разграничения экзогенный чГР эндогенной форме. Таким образом, ток одобрен метод обнаружения экзогенного чГР основан на измерении отношение 22 кДа чГР изоформы по отношению к 20 кДа изоформы. Поскольку испытание изоформы требования для измерения многократного ГРЧ изоформы одновременно в течение короткого периода времени в широком диапазоне концентраций, таким образом, мы рассмотрели платформу SPRI как идеальный матч. Кроме того, эндогенные чГР уровень колебаться в очень низком уровне (0,03 нг / мл) в крови, следовательно, система обнаружения должен быть способен измерять этот диапазон удобно с высоким зрecificity. В результате, мы также исследовали в данном исследовании потенциал Nano-SPRI в качестве диагностического инструмента для ГР и сравнил его непосредственно SPRI и классической иммунологического ELISA.
На основании результатов, полученных в этом исследовании, основное преимущество метода SPRI и нано-SPRI, что концентрации рчГР может быть измерена в более быстром образом, по сравнению с более традиционным методом ELISA. Стандартная продолжительность для измерения уровня рчГР в одном образце с помощью метода прямого обнаружения был 1 час в то время как Нано-SPRI требуется 2 ч из-за дополнительных шагов в этом процессе. В целом, с SPRI и нано-SPRI экспериментов, перед инъекцией образца, шаг калибровки рекомендуется. Кроме того, инъекции сырого образца, как результаты человеческой сыворотке в некоторых неспецифических взаимодействий в результате крайне важно, чтобы придать высокую буферную соль стирки только выявить специфические взаимодействия. Стоит также отметить, что стадия промывки является абсолютно необходимымпосле введения блокирующих молекул на поверхность датчика, для удаления несвязанных молекул. Что касается требований времени ELISA, намного больше (~ 16-18 часов) для анализа одного образца. Необходим более длительное время инкубации, как чувствительность анализа усиливается специально для этого исследования, а основное внимание было сравнить нижний предел обнаружения.
Выбор поверхностной химии будет изменяться от одного применения к другому, и это может быть реализовано в качестве одного из ограничений техники SPRI. В этом исследовании, широкий ассортимент и сочетание химических линкеров и блокирующих молекул были оценены достижения правильного сочетания для того, чтобы наблюдать оптимальный связывания эффективность рчГР на поверхность датчика. Например, в этом исследовании, сочетание BSA и ПЭГ служил также в минимизации неспецифических взаимодействий. Тем не менее, в предыдущем исследовании, где 17 захвата лиганд был аптамеры, ПЭГ одна служил в качестве лучшего молекулы блокировки. Переменныекоторые влияют на эффективность связывания с лигандом аналита также зависит от рН, буфер и температура. Таким образом, в любом приложении, эти переменные должны быть оптимизированы. Кроме того, очень важно, чтобы определить оптимальную концентрацию пятнистость лиганда с поверхностью чипа. Титрование эксперимент с диапазоном концентраций иммобилизованного лиганда выполняется до начала исследования. Что касается ELISA, является важным шагом в процедуре было переливать промывочный буфер из лунок, постукивая планшет как это обеспечивается не остаточная жидкость не остатки. Удаление промывочного буфера с пипеткой, не было достаточно, как и любой остаточную жидкость мешал считывания сигнала целевого образца.
В связи с чувствительностью, ИФА (1 нг / мл) сравнима с SPRI (3,61 нг / мл), но нано-SPRI (9.20 пг / мл) повышает чувствительность на три порядка величины, что позволяет измерения на более низких биологических уровнях рчГР 0.03 нг / мл. Как сообщалось ранее 16,17, усиление сигнала даваемые NanoEnhancers приписывается массового эффекта нагрузки и сильной связи, которая существует между NIR флуорофорами и распространяющихся поверхностных плазмонов для золота пленочных наноструктур. Даже если, Нано-SPRI добавляет дополнительный шаг к процедуре, этот уровень чувствительности может расширить применение технологии SPRI в различных торговых точках.
SPRI обеспечивает ученым полную кинетическую анкету (Уб, К и К г) антитела / рчГР взаимодействия, тогда как ELISA может сообщить только значения сродства. Коэффициент вариации (КВ) был ниже 10% для SPRI (4,1%) и ELISA (6,5%), что свидетельствует хорошую воспроизводимость. Значения сродства ELISA и SPRI отличаться, так как антитела захвата иммобилизованным на чипе датчика отличаются от иммобилизованных антител в ELISA 96-луночного планшета. Что касается Nano-SPRI наблюдалось более высокое значение CV (20%). Есть несколько параметров, которые могут способствовать как источник ErroRS для определения CV. Например, в эксперименте Нано-SPRI гораздо ниже концентрация анализируемого измеряемого, добавление NanoEnhancers добавляет еще один шаг в процедуре, и эксперимент был проведен вручную. Очень хорошая корреляция между нано-SPRI и ELISA была достигнута для обнаружения рчГР в шипами человеческой сыворотке. Наконец, ELISA может быть надежным методом, однако сам метод занимает много времени, что делает его трудно использовать в ситуациях, требующих реального времени мониторинг и мультиплексирование, как это имеет место с ГР. Кроме того, более привлекательной особенностью, что не исследовалось непосредственно в этом исследовании, что SPRI предлагает более ELISA, является способность измерить сотни взаимодействий одновременно в режиме реального времени. Поэтому в будущем, метод Nano-SPRI будет оцениваться, чтобы обнаружить несколько биомаркеров одновременно в режиме реального времени (мультиплексирования), присутствующие в сыворотке при различных концентрациях для того, чтобы изучить его потенциал в качестве жизнеспособного клинического диагностического инструмента.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NanoManufacturing Innovation Consortium for funding support.
Materials
| Somatotropin Growth Hormone (GH1) capture antibody | Acris Antibodies | DM1015 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP671-10 | |
| Biotin labeled Somatotropin Growth Hormone (GH1) detection antibody | Acris Antibodies | AM09304BT-N | |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | TCI America | D1601 | |
| Ethanolamine | Acros Organics | 141-43-5 | |
| Ethanol | Fisher Chemicals | BP2818-4 | |
| Human HGH ELISA Kit | invitrogen | KAQ1081 | |
| Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | |
| Rabbit IgG Antibody | Sigma Aldrich | I5006 | |
| 11-mercaptoundecanoic acid | Sigma Aldrich | 450561 | |
| Nanostrip | Cyantek | ||
| N-hydroxysuccinimide | Sigma Aldrich | 130672 | |
| Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 00-3002 | |
| Polyethylene glycol (800 Da) | Sigma Aldrich | 729108 | |
| Recombinant Human Growth Hormone | Calbiochem | 869008 | |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | 127-09-3 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemicals | 7647-14-5 | |
| Streptavidin coated near infrared quantum dots | Life Technologies | Q10171MP | |
| UV/Ozone Procleaner | Bioforce Nanosciences | ||
| Microwave reactor | CEM Corporation | Discover system | |
| SPRi-Arrayer | LabNext Xactll Microarray System | ||
| SPR biochip | HORIBA | ||
| SPRi-Lab+ | HORIBA | ||
| Synergy Mx Multimode Microplate reader | BioTek | ||
| ScrubberGen | HORIBA | Data Analysis software |
References
- Popii, V., Baumann, G. Laboratory measurement of growth hormone. Clinica Chimica Acta. 350 (1-2), 1-16 (2004).
- Higham, C. E., Trainer, P. J. Growth hormone excess and the development of growth hormone receptor antagonists. Exp Physiol. 93 (11), 1157-1169 (2008).
- Sönksen, P., Salomon, F., Cuneo, R. Metabolic effects of hypopituitarism and acromegaly. Horm Res. 36, 27-31 (1991).
- Molitch, M., et al. Evaluation and Treatment of Adult Growth Hormone Deficiency: An Endocrine Society Clinical Practice Guideline. J Clin Endocrinol Metab. 91 (5), 1621-1634 (2006).
- . . The World Anti-Doping Code: The 2015 Prohibited List International Standard. , (2015).
- . . The 2014 prohibited list world anti-doping code. , (2014).
- Langkamp, M., Weber, K., Ranke, M. B. Human growth hormone measurement by means of a sensitive ELISA of whole blood spots on filter paper. Growth Horm IGF Res. 18 (6), 526-532 (2008).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Survey of the year 2007 commercial optical biosensor literature. J Mol Recognit. 21 (6), 355-400 (2008).
- Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal Bioanal Chem. 377 (3), 528-539 (2003).
- Hoa, X. D., Kirk, A. G., Tabrizian, M. Toward Integrated Surface Plasmon Resonance Biosensors: A Review of Recent Progress. Biosens Bioelectron. 23 (2), 151-160 (2007).
- de Juan-Franco, E., Rodrìguez-Frade, J. M., Mellado, M., Lechuga, L. M. Implementation of a SPR immunosensor for the simultaneous detection of the 22K and 20K hGH isoforms in human serum samples. Talanta. 114, 268-275 (2013).
- de Juan-Franco, E., Caruz, A., Pedrajas, J. R., Lechuga, L. M. Site-directed antibody immobilization using a protein A-gold binding domain fusion protein for enhanced SPR immunosensing. Analyst. 138 (7), 2023-2031 (2013).
- Du, H., et al. Immunological screening and characterization of highly specific monoclonal antibodies against 20 kDa hGH. Bioanalysis. 4 (17), 2161-2168 (2012).
- Treviño, J., Calle, A., Rodrìguez-Frade, J. M., Mellado, M., Lechuga, L. M. Surface plasmon resonance immunoassay analysis of pituitary hormones in urine and serum samples. Clin Chim Acta. 403 (1-2), 56-62 (2009).
- Wu, Z., Bidlingmaier, M., Dall, R., Strasburger, C. J. Detection of doping with human growth hormone. Lancet. 353 (9156), 895 (1999).
- Malic, L., Sandros, M. G., Tabrizian, M. Designed biointerface using near-infrared quantum dots for ultrasensitive surface plasmon resonance imaging biosensors. Anal. Chem. 83 (13), 5222-5229 (2011).
- Vance, S. A., Sandros, M. G. Zeptomole Detection of C-Reactive Protein in Serum by a Nanoparticle Amplified Surface Plasmon Resonance Imaging Aptasensor. Sci. Rep. 4 (5129), 1-7 (2014).
- Uludag, Y., Tothill, I. E. Cancer biomarker detection in serum samples using surface plasmon resonance and quartz crystal microbalance sensors with nanoparticle signal amplification. Anal. Chem. 84 (14), 5898-5904 (2012).
- Špringer, T., Homola, J. Biofunctionalized gold nanoparticles for SPR-biosensor-based detection of CEA in blood plasma. Anal Bioanal Chem. 404 (10), 2869-2875 (2012).
