JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Vergelijkende analyse van menselijk groeihormoon in het serum met behulp spri, Nano-SPRI en ELISA assays

Published: January 07, 2016
doi:
10.3791/53508
, , ,
1Department of Nanoscience,University of North Carolina at Greensboro, 2Center for Biotechnology, Genomics, and Health Research,University of North Carolina at Greensboro, 3HORIBA Scientific

Summary

De voorgestelde werk beoordeelt het diagnostische potentieel van directe en geamplificeerd surface plasmon resonance imaging (lent) assays, met name voor de detectie van recombinant humaan groeihormoon bij spiked humaan serum door vergelijking lent resultaten direct met commercieel verkrijgbare enzym-gekoppelde immunosorbent assay (ELISA) kit.

Abstract

Gevoelige en selectieve werkwijzen voor de detectie van humaan groeihormoon (hGH) over uiteenlopende concentraties (hoge 50-100 ng ml – 1 en minimumniveaus van 0,03 ng ml – 1) in circulerend bloed essentieel variabele wordt soms geven veranderde fysiologie. Zo kunnen groeistoornissen optreden bij kinderen worden gediagnosticeerd door het meten van niveaus van hGH in bloed. Ook het misbruik van recombinant hGH in de sport vormt niet alleen een ethische kwestie het presenteert ook ernstige bedreigingen voor de gezondheid aan de dader. Een populaire strategie voor het meten hGH misbruik, gebaseerd op de detectie van de verhouding van 22 kDa hGH aan totale hGH, niet-22 kDa endogene niveaus Find exogeen recombinant hGH (rhGH) toediening. Surface plasmon resonance imaging (SPRI) is een analytische tool die direct (label-free) bewaking en visualisatie van biomoleculaire interacties mogelijk maakt door het opnemen van veranderingen van de refractie-index grenzend aan het sensoroppervlak in real time. Daarentegen is de meest gebruikte colorimetrische methode, enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) gebruikt enzym gemerkte antilichamen voor detectie indirect meten analytconcentratie na toevoeging van een substraat dat een kleurverandering veroorzaakt. Om detectie gevoeligheid te verhogen, versterkt SPRI maakt gebruik van een sandwich assay formaat en nabij-infrarood quantum dots (QDs) om de signaalsterkte te verhogen. Na directe spri detectie van recombinant rhGH in spiked humaan serum, wordt de SPRI signaal versterkt door de opeenvolgende injectie van detectieantilichaam bekleed met nabij-infrarood QDs (Nano-SPRI). In dit onderzoek werd de diagnostische potentieel van directe en geamplificeerd SPRI werd bepaald voor het meten van rhGH spiked in menselijk serum en direct vergeleken met de mogelijkheden van een commercieel verkrijgbare ELISA-kit.

Introduction

Menselijk groeihormoon (hGH) is een 191 aminozuur peptide (22 kDa) geproduceerd door de hypofyse en rechtstreeks in de bloedbaan. Interacties tussen de hypothalamus peptide groeihormoon-releasing hormoon (GHRH) en somatotropine veroorzaken pulsatiele afscheiding van hGH. Daardoor niveaus van hGH variëren van pieken in de 50-100 ng / ml om de lows 0,03 ng / ml bereik 1. Tekort of overschot van hGH in het lichaam kan een brede waaier van abnormale fysiologische verschijnselen veroorzaken. Bijvoorbeeld, kan een teveel aan hGH leiden tot gigantisme 2 en diabetes 3. Uitgeputte niveaus van hGH veroorzaken lage bloedsuikerspiegel bij pasgeborenen, en zwakke botdichtheid en depressie bij volwassenen 4.

De administratie van de recombinante vorm van hGH (rhGH) verbetert de spiermassa, terwijl het verminderen van lichaamsvet. Als zodanig, werd deze stof het middel van keuze voor professionele en amateur-sporters als het verbetert de fysieke kracht dat een adv verleentantage in competitieve sporten. rhGH wordt verboden door het Wereld Anti-Doping Agentschap (WADA) 5,6 en veel inspanning door internationale onderzoekers is gericht op de ontwikkeling van tests die de aanwezigheid of anabole werking kan detecteren.

Enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) is de voorkeursmethode voor de bepaling van hGH in volbloed 7 geweest. Hoewel ELISA is een betrouwbare techniek met goede gevoeligheid en selectiviteit, is het relatief tijds- en arbeidsintensief. Bovendien ELISA gebaseerd op de indirecte detectie van hGH door toepassing van enzymatische labels. Daarentegen oppervlakte plasmon resonance (SPR) maakt de detectie van hGH direct zonder het gebruik van labels in real time. De detectie principe SPR omvat een detectieoppervlak dat bestaat uit een prisma die is bekleed met een dunne metaallaag (goud of zilver); wanneer een monochroom gepolariseerd licht interageert met het metalen oppervlak, zijn "oppervlakteplasmonen" gegenereerd. Het binden van een analyteen oppervlakte receptor geïmmobiliseerd op het metaaloppervlak verstoort de resonantie omstandigheden die leiden tot een verschoven resonantie dip, die vervolgens kunnen worden gecorreleerd met de analytconcentratie. SPR-gebaseerde biosensoren zijn nu in de handel verkrijgbaar die een real-time, label-free techniek om te controleren biomoleculaire binding gebeurtenissen en biochemische reacties 8-10 bieden. Recenter lent ontwikkeld als antwoord op de behoefte aan multiplexing (dwz oogopslag meerdere bindinggebeurtenissen tegelijkertijd), die in klassieke SPR biosensoren onmogelijk was. Zo heeft SPRI ontpopt als een instrument om gelijktijdig meerdere monitoren binding gebeurtenissen. Huidige spri zijn gebaseerd op microscopische beeldvorming van een oppervlak dat wordt geëxciteerd met licht bij een bepaalde hoek en golflengte 10. Het beeld wordt vervolgens opgevangen op een ladingsgekoppelde inrichting (CCD) array.

Tot op heden zijn er een paar SPR-gebaseerde assays om hGH 11-14 detecteren zijn. Een bijzondere strategie, Bekend als de methode isovorm 15, gebaseerd op de detectie van de verhouding van 22 kDa hGH aan totale hGH, non-22-kDa endogene spiegels Find rhGH exogene toediening. Onlangs, de Juan-Franco et al. 11 gerapporteerd over de ontwikkeling van een SPR-gebaseerde immunosensor voor de selectieve detectie van de 22 kDa en 20 kDa hGH-isovormen in humane serummonsters. Monoklonale antilichamen die specifiek zijn voor elke isovorm werden direct geïmmobiliseerd op de sensor goud waardoor de meting van beide isovormen gelijktijdig in een enkele injectie met een detectielimiet van 0,9 ng ml -1. Alternatief is SPR werd gebruikt om antilichamen met een hoge specificiteit voor hGH scherm 13. Als de concentratie van doelanalyt beneden detectielimiet van de SPRI systeem (<nM), moet men zijn toevlucht tot het versterken van de SPRI signaal via het gebruik van nanodeeltjes (Nano-SPRI). Dergelijke SPR-gebaseerde amplificatie is goed gedocumenteerd in de literatuur 16-19 voor verschillende types analyt en oppervlakken.

In dit werk, de analytische mogelijkheden van SPRI en nano-SPRI gebaseerde biosensoren onderzocht, met name voor de detectie van rhGH in spiked humaan serum, en vergelijking van het detectievermogen direct ELISA. De volgende parameters zullen worden beoordeeld en overwogen: detectie tijd, gevoeligheid, kinetisch profiel, reproduceerbaarheid en specificiteit.

Protocol

1. Voorbereiding van de Solutions en Eiwit Monsters voor SPRI Bereid 100 ml zoutarm fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) die 10 mM fosfaat, 150 mM natriumchloride, pH 7,4 en. Maak 50 ml van een hoog zoutgehalte PBS bevattende 10 mM fosfaat, 750 mM natriumchloride, pH 7,4 en. Bereid 5 ml 10 mM natriumacetaat. Bereid een voorraad van 5 mg / ml runderserumalbumine (BSA) verdund in zoutarm PBS-oplossing. Bereid een voorraadoplossing van recombinant humaan groeihormoon (rhGH) bij een concentratie van 1 ug / ml in PBS-oplossing met laag zoutgehalte. Bereid voorraadoplossingen van anti-rhGH en negatieve controle antilichaam bij een concentratie van 100 ug / ml. 2. Bereid spri Chip voor antilichaam Array Reinig de chip door sonicatie in 120 ml gestabiliseerde Piranha-oplossing (3: 1 geconcentreerd zwavelzuur tot 30% waterstofperoxide) gedurende 90 min bij 50 ° C en volg door afspoelenen sonicatie met water gedurende 5 minuten. Daarna spoelen chip met ethanol en droog met stikstof stroom. Plaats de gouden chip in een UV / ozon kamer gedurende 30 minuten om eventuele verontreinigingen te verwijderen. Voeg 150 mg 11-mercaptoundecanoic zuur aan 20 ml ethanol in een reageerbuis die een roerstaaf en een dopje bevat. Plaats chip in de reageerbuis en magnetron tube / chip bij 50 W en 50 ° C gedurende 5 min. Spoel chip met ethanol en genieten in ethanol gedurende 5 minuten. Te volgen door een spoeling met water en weken in water gedurende 5 minuten. Voeg 150 mg 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide aan 20 ml water in een reageerbuis die een roerstaaf en een dopje bevat. Microgolfchips zoals in stap 2,4. Spoel chip met water en weken in water gedurende 5 minuten. Voeg 150 mg N-hydroxysuccinimide in 20 ml water in een reageerbuis die een roerstaaf en een dopje bevat. Microgolfchips zoals in stap 2,4. Spoel chip met water en weken in water gedurende 5 minuten. Prepare 250 pM polyethyleenglycol (PEG, 800 Da) in 20 ml water in een reageerbuis die een roerstaaf en een dopje bevat. Microgolfchips zoals in stap 2,4. Opmerking: microwaving PEG800 op het oppervlak van de sensor uitgevoerd als een blokkerend stap te voorkomen dat niet-specifieke binding van serumeiwitten en quantum dot complexen later gebruikt in het experiment. Dit wordt bereikt door PEG800 laten reageren met niet-bezette bare gold plaatsen op de chip. Spoel chip met water en weken in water gedurende 5 minuten. Bereid 15 pg / ml anti-rhGH antilichaamoplossing en negatieve controleoplossing anti-immunoglobuline G (anti-IgG) en voeg 10 ul van elk antilichaam oplossing van een putje in de plaat met 384 putjes. Het ontwerp van de spotting patroon in de microarrayprinter (4 x 7 kwadranten voor elk monster) en spot chip met antilichamen met behulp van een 500 urn Teflon getipt pin. Incubeer bevlekte chip gedurende 2 uur bij kamertemperatuur en onder een vochtige atmosfeer van 75% of meer. Spoel en genieten chip in water5 minuten. Dan, droge chip met stikstof stroom. 3. spri Experiment Setup en blokkeren Initialiseren van het instrument en selecteer directory. Selecteer realtime camera en start de injectiepomp bij 1 ml / min gedurende 10 ml ontgast water. Plaats chip in het instrument en het injecteren van water te houden totdat alle luchtbellen worden verwijderd. Na spoelen chip met 10 ml water, beginnen beeldacquisitie en te volgen door het schakelen van de buffer met laag zoutgehalte PBS en laten lopen bij 1 ml / min gedurende 5 ml en daarna langzaam debiet tot aan 20 pl / min gedurende 20 min . Selecteer de sterk contrast beeld, dat de geïmmobiliseerde antilichamen gespot op de chip toont. Selecteren en de 400 um afzonderlijke ronde punten overeenkomen met de geïmmobiliseerde antilichamen. Nadat het instrument traceert de plasmon bochten, kies een werkhoek dat de hoogste helling in de reflectiviteit bochten heeft. Flow een lopende buffer bij 20 pl / min lage salt PBS door middel van het systeem tot het signaal van alle geselecteerde plekken stabiliseert. Laad de BSA (100 ug / ml) in loopbuffer in de monsterlus (150 pl) met de injectieklep in de laadpositie. Vervolgens schakelt de klep naar de injectiepositie naar de oplossing van de stroomcel injecteren. Opmerking: BSA geïnjecteerd covalent binden aan het amine reactieve oppervlak, wordt het resterende niet-gebonden BSA wassen het oppervlak met buffer spoelen. Injecteer 150 ui van een oplossing van 10 mM natriumacetaat over het oppervlak en volgen door 150 gl injectie van hoge zout PBS. Injecteer 150 ui ethanolamine (1 mM) aan het amine reactief oppervlak te deactiveren. Injecteer 150 ui 10 mM natriumacetaat aan het oppervlak te wassen. Schakel dan de loopbuffer PBS met 50 ug / ml BSA bij een stroomsnelheid van 250 pl / min gedurende een totaal van 5 ml. Opmerking: 50 ug / ml BSA toegevoegd aan de loopbuffer extra blokkering van de surgezicht door non-covalente bezetten de aspecifieke plaatsen en dit wordt gedaan om verder te reduceren aspecifieke binding van serumeiwitten aan het oppervlak. Verandering stroomsnelheid tot 5 pl / min en laat het stabiliseren gedurende 20 min. 4. spri Detectie van Human Growth Hormone Bereid een oplossing van een reeks concentraties van rhGH (30.000 pg / ml, 250 pg / ml, 25 pg / ml; 2,5 pg / ml en 0,25 pg / ml) in 10% serum en verdund in PBS dat 1 mg / ml BSA. Bereid een 2: 1 door toevoeging van 1 pi biotine gemerkt anti-rhGH-detectie-antilichamen (6 uM) aan 3 ui streptavidine beklede nabij infrarood quantum dots (1 uM) in een 0,5 ml microcentrifuge buis en incubeer gedurende 30 min doeltreffend koppelen . Injecteer 150 ui van het hGH spiked humaan serum oplossing in de injectie lus. Dit resulteert in een sterke toename van het signaal, gevolgd door een langzame daling van de niet-specifiek gebonden serum afspoelen van het oppervlak. Zodra het tekenal stabiliseert, was het oppervlak met een oplossing van 450 mM natriumchloride toegevoegd aan de loopbuffer. Verdun de oplossing van anti-rhGH detectie antilichamen en quantum dots tot een concentratie van 10 nM (2: 1) met loopbuffer (PBS met 50 ug / ml BSA) en injecteren in de stroomcel. 5. SPRI Data Analyse Opmerking: Na de injectie van de rhGH spiked humaan serum en quantum dot versterker, een toename van reflectie verandering optreedt als gevolg van de versterkte verschuiving van de plasmon curves. Dit resulteert afbeelding een verschil een afbeelding grijsschaal correleren om het signaal van de op de chip tonen in. De gegevens importeren in een data-analyse programma. Plot het spri signaal (% reflectiviteit) versus tijd (s) en het bepalen van het verschil tussen de anti-rhGH en negatieve controle antilichaam vlekken na de hoge zout wassen. 6. ELISA Protocol (dag 1) Bewaar alle assay componenten opgenomen in de rhGH ELISA-kit bij 2-8 ° C. Dit omvat de anti-rhGH antilichaam beklede putjes, standaards (0-5) bij schapen serum controles (1 & 2) in humaan serum, conjugaatbuffer (200x) wasbuffer, chromogeen TMB (tetramethylbenzidine) en stop reagens. Stel de reagentia en volgt de werkwijzen zoals beschreven in de commerciële ELISA-kit protocol. Ten eerste kan de anti-rhGH antilichaam beklede 96-wells tot KT verwarmen voor het openen van de folieverpakking. Verwijder vervolgens het gewenste aantal 8-en strips voor de test en sluit de folieverpakking met de resterende putten en bewaar bij 2-8 ° C. Bereid normen reconstitutie in 2 ml gedestilleerd water voor standaard # 0, in 1 ml gedestilleerd water voor standaarden (1-5) en in 1 ml gedestilleerd water voor de controles (1 en 2). Hieronder staat een tabel met de corresponderende concentraties van de normen en controles (tabel 1): <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-met-next.within-page = "always"> Standaarden Concentratie (ng / ml) 0 0 1 0.17 2 0.94 3 2.63 4 10.4 5 26.9 Controle # 1 1,22 ± 0,33 ng / ml Controle # 2 4,97 ± 1,25 ng / ml Tabel 1. De concentraties van de standaarden en controles in de commerciële ELISA-kit. Bereid de monsters die uit de rhGH hormoon in 10% humaan serum bij de volgende concentraties (tabel 2): <strong> Voorbeeld Concentratie (ng / ml) 1 0,025 2 0.2 3 0.5 4 2.5 5 10 6 30 Tabel 2. De concentraties van de rhGH monsters bereid in 10% serum. Voeg 50 ul van elke standaard, controle en monster aan elk putje (in triplo). Verzegeling van de putten en incubeer met de standaarden, controles, en rhGH monsters O / N bij 4 ° C onder voorzichtig schudden. 7. ELISA Protocol (dag 2) Verwijder de plaat uit de schudinrichting en laat het opwarmen tot kamertemperatuur (15-20 min) voorafgaand aan verder gaat met de assay. Verwijder de anti-rhGH-HRP conjugaat buffer, wasbuffer (200x), chromogeen TMB (tetramethylbenzidine), eend stopreagens uit de koelkast en laat het opwarmen tot kamertemperatuur. Reagens voorbereiding: (volgens de specificaties van de fabrikant) Verdun de anti-rhGH-HRP 40x met het conjugaat buffer. Bereid de wasbuffer door verdunning 200x met gedestilleerd water. Voeg 50 ul van anti-rhGH-HRP conjugaat in elk putje, verzegelen de putjes en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten onder zacht schudden. Schenk de oplossing uit de putten en omkeren van de plaat en tik droog op een absorberend weefsel. Voeg dan 200 ul wasbuffer in elk putje. Schenk de wasoplossing en tik droog op een absorberend weefsel. Herhaal deze stap 3 keer. Voeg 100 ul van chromogeen in elk putje binnen 15 min na de wasstap. Incubeer gedurende 30 min bij kamertemperatuur in het donker onder zacht schudden. De oplossingen draaien van kleurloos naar blauw. Voeg 100 ul van het stopreagens in elk putje. De oplossingen van blauw naar geel. Onmiddellijk lezen the absorptie van elk putje bij 450 nm met behulp van een microplaat reader. Plot van de standaard curve voor de geleverde normen (0-5). Vervolgens brengen de optische dichtheid van de rhGH in 10% serummonsters versus concentratie van elk monster.

Representative Results

De prestaties van SPRI en nano-SPRI (SPRI dienst van de NanoEnhancers) vergeleken met ELISA voor de detectie van rhGH in een complexe omgeving. De verschillen in de opzet van deze methoden worden hier kort beschreven. Voor spri (directe detectie, figuur 1), wordt het invangantilichaam geïmmobiliseerd op het oppervlak en vervolgens het monster geïnjecteerd en binding van de analyt aan het sensoroppervlak wordt direct gemeten in realtime-label vrije manier. Echter, met nano-de le (figuur 1), na de analyt bindt aan het sensoroppervlak een opeenvolgende injectie gevolgd quantum dots bekleed met detectie antilichamen tegen het SPRI signaal te versterken. Figuur 1. Een schematische weergave vergelijking van direct-modus (SPRI) en versterkt-modus (Nano-SPRI) van de detectie van rhGH in c onbeschoft monsters. liganden (rhGH of IgG-specifieke antilichamen) werden geïmmobiliseerd in een array formaat op de SPRI biochip. Doeleiwit (rhGH) spiked in menselijk serum ingevoerd om de sensor oppervlak direct gedetecteerd (SPRI) en opeenvolgend gemarkeerd met NanoEnhancers (Nano-SPRI). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Zoals voor ELISA, de multi- platen arriveren al pre-gefunctionaliseerd met capture antilichaam en vervolgens monster wordt geïntroduceerd, het analyseren van de rente zal binden. Een detectieantilichaam wordt ingebracht gevolgd door toevoeging substraat. De optische dichtheid wordt vervolgens gemeten bij 450 nm. In deze studie werd een commerciële ELISA-kit (Figuur 2) werd gebruikt voor het meten rhGH spiked in 10% humaan serum. 8 / 53508fig2.jpg "/> Figuur 2. Een schematische weergave van ELISA-assay procedure. rhGH eiwit (blauwe ovalen) wordt ingebracht in putjes die vooraf zijn gefunctionaliseerd met monoklonale antilichamen (geel) specifiek voor rhGH. Niet-specifieke interacties worden verwijderd door spoelen van de putjes met wasbuffer gevolgd door de introductie van een detectieantilichaam prefunctionalized met mierikswortel peroxidase (HRP, paars). De oplossing zal veranderen van kleur na het toevoegen van het substraat tetramethylbenzidine (TMB, goud). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3 geeft de titratiecurve van rhGH ingespoten in 10% humaan serum en wordt uitgezet tegen de verkregen OD bij 450 nm. Een goede lineaire respons waargenomen en de detectielimiet werd bepaald op 1 ng / ml te zijn. De coëfficiënt van variation (CV) was 6,5% suggereert goede reproduceerbaarheid. Figuur 3. ELISA data-analyse. Concentratie van rhGH spiked in serum wordt uitgezet tegen de verkregen OD bij 450 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Vervolgens wordt de detectie van rhGH ingespoten in humaan serum werd bepaald met SPRI. Directe detectie van rhGH resulteerde de overeenkomstige concentratiegradiënt curve (figuur 4), elk punt vertegenwoordigt de gemiddelde waarde van de reflectiviteit verschil berekend uit drie lent kinetische curves voor elke concentratie. De detectiegrens (LOD) werd bepaald als zijnde 3,61 ng / ml. De spri directe detectie assay was zeer reproduceerbaar de CV van de assayslechts 4,1%. Figuur 4. Direct lent detectie van hGH ingespoten in 10% humaan serum. De resulterende genormaliseerde lent kinetische plot na injectie van diverse hoeveelheden hGH spiked in humaan serum, gevolgd door de injectie van een hoge zout buffer (verticale stippellijn) te verwijderen non -specifieke interacties. Een concentratie gradiënt curve die de binding van verschillende hoeveelheden hGH spiked in humaan serum op de sensor oppervlak is prefunctionalized met gebiotinyleerd hGH-specifieke antilichamen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Om de gevoeligheid van de SPRI biosensor te verhogen, NanoEnhancers (QDs vooraf gefunctionaliseerd met detectie antilichamen) worden achtereenvolgens introduced het sensoroppervlak om de aanwezigheid van rhGH benadrukken spiked in humaan serum. Na achtergrond aftrek, de NanoEnhancers konden de biosensor reactie tot amplificeren tot 7,9%, echter met een minimale signaalverandering (Immunoglobuline G (IgG) -specifieke antilichamen, 0,38% verandering in reflectiviteit Figuur 5 gereguleerde gebieden van belang Beeldvorming. de sensor oppervlak blijkt dat slechts regio's van belang dat rhGH-specifieke antilichamen geïmmobiliseerd ervaring de grootste contrast verandering direct ondersteunend met de kinetische sensorgram respons. Figuur 5. Detectie van rhGH gebruik van een sandwich assay spiked in 10% humaan serum. SPRI kinetische plot na de injectie van rhGH (30 ng / ml) in buffer (10 mM PBS, 150 mM natriumchloride, pH = 7,4) op een vooraf -functionalized chip met 11-mercaptoundecanoic zuur / rhGH-specifiek antilichaam en controle IgG-antilichaam vervolgens geblokkeerd met BSA, gevolgd door de toevoeging van de detectie-antilichaam beklede quantum dots (NanoEnhancers). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Om de uitvoerbaarheid van de nano-lent biosensor demonstreren het meetbereik van rhGH in ruwe monsters werd beoordeeld. Een uitgebreid werkbereik van 30.000 pg / ml tot 0,25 pg / ml resulteerde als reactie op de toevoeging van NanoEnhancers (figuur 6). Vermeldenswaard is dat elk punt op de titratiecurve wordt het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten. Bijgevolg is de onderste detectielimiet berekend 9,20 pg / ml is en de variatiecoëfficiënt was 20%. Figuur 6.Nano-spri detectie van hGH ingespoten in humaan serum. Genormaliseerde lent kinetische plot-representatie van hGH_specific_Anti QDs-versterkt signaal voor menselijke serummonsters waaraan verschillende concentraties hGH. Een verticale stippellijn (grijs) vertegenwoordigt de injectie punt van de lopende buffer. (b) een concentratiegradiënt curve die de binding van NanoEnhancers (hGH_specific_Anti-QDs) na injectie van diverse hoeveelheden hGH spiked in menselijk serum aan het sensoroppervlak die is prefunctionalized met 11-mercaptoundecanoic zuur / hGH antilichaam. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Vervolgens wordt de verandering die optreedt in de SPR reflectiviteit als functie van de concentratie werd vergeleken tussen de directe en NanoEnhancer bioassay (figuur 7). Voor de directe debescherming techniek tussen 25 en 0,25 pg / ml, het signaal begon plateau en dit is niet verwonderlijk aangezien deze concentraties beneden de aantoonbaarheidsgrens van 3 ng / ml (Figuur 7). Ook voor het geamplificeerde techniek concentraties beneden de aantoonbaarheidsgrens van 9,2 pg / ml signaal begon af te vlakken en toonde nagenoeg geen variatie. Figuur 7. Een vergelijkende analyse van SPRI met nano-lent. Dit staafdiagram toont het percentage verandering in reflectiviteit (% R) na invoering van rhGH spiked in humaan serum (directe detectie), gevolgd door de injectie van NanoEnhancers (versterkte detectie) voor 30.000 pg / ml, 250 pg / ml, 25 pg / ml, 2,5 pg / ml en 0,25 pg / ml. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-pagina = "1"> Ook de specificiteit van de Nano-SPRI biosensor werd beoordeeld. Insuline-achtige groeifactor-1 (IGF-1) spiked in humaan serum werd geïnjecteerd als een controle omdat hGH bevordert de secretie van IGF-1 door de groeihormoon receptor op de hepatocyt membraan. Na de injectie van IGF-1 in het serum werden de NanoEnhancers sequentieel geïnjecteerd en het SPR signaal reactie zijn geen specifieke binding (figuur 8) vertonen. Wanneer echter rhGH spiked in serummonster werd geïnjecteerd naar dezelfde plek gefunctionaliseerd met rhGH antilichaam werd signaalversterking waargenomen. Tot slot heeft de Nano-SPRI platform uitstekende specificiteit en selectiviteit voor rhGH aangetoond. Figuur 8. Beoordeling van de Nano-SPRI selectiviteit naar rhGH. De Nano-SPRI biosensor reactie na de injectie van rhGH (zwart) en IGF-1 (rood) in 'sgehoekte serum. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Een correlatie analyse werd uitgevoerd met de Pearson correlatiecoëfficiënt om de correlatie tussen de lent signaalintensiteit en ELISA optische dichtheidswaarden (figuur 9) te bepalen. Een p-waarde <0,01 werd als significant beschouwd. Zoals in deze grafiek, is er een goede correlatie tussen de rhGH niveaus spiked humaan serum gemeten met lent en ELISA. De R-waarde was 0,9263 9 verschillende monsters. Figuur 9. Pearson correlatieanalyse tussen ELISA en Nano-SPRI. Het perceel correleert Nano-SPRI signaalintensiteit (y-as) met ELISA optische dichtheid (x-as) waarden. (Perenop correlatiecoëfficiënt n = 9, R = 0,9263, p = 0,00000183). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. De evenwichtsdissociatieconstante (KD) werd bepaald met behulp van GraphPad software voor ELISA. De berekende KD waarde was ongeveer 79 nM (tabel 3). De aan (Ka) en uit (Kd) tarieven kon niet worden bepaald met ELISA. Bij gebruikmaking van de software voor gegevensanalyse, de directe detectiemethode geleid K D-waarde van 23 pM met de molecuulmassa van 22 kDa die overeenkomt met een rhGH molecuul. De aan en uit werden berekend op 6,1 x10 7 M -1 s -1 en 1,33 x 10 -3 s -1, respectievelijk. Dit vertaalt zich inherent dat 0,13% van de rhGH en antilichaam complexen verval per seconde. Als het eenmplified spri experiment werd een sterkere algehele interactie waargenomen tussen NanoEnhancers en rhGH als de berekende bindingsaffiniteit was vastbesloten om 04:03 zijn. Daarnaast werd een sterkere associatiesnelheid waargenomen voor NanoEnhancers en rhGH dan invangantilichaam / rhGH, maar de dissociatiesnelheid blijkt dat 0,26% van NanoEnhancer / rhGH / invangantilichaam verval per seconde. Methode KD (Affinity) K een (on-rate) K d (off-rate) LOD ELISA 79,45 x 10 -9 M NA NA 1 ng / ml SPRI 23,2 x 10 -12 M 6,1 x 10 7 M -1 sec -1 <td> 1,33 x10 -3 sec -1 3,61 ng / ml Nano-SPRI 4,33 x 10 -12 M 7,54 x10 8 M -1 sec -1 2,62 x10 -3 sec -1 0,0092 ng / ml Tabel 3. Volledige kinetische data-analyse. Evaluatie van de affiniteit, on-rate en off-rate van het antilichaam reacties met behulp van GraphPad (ELISA) en data-analyse (SPRI en Nano-SPRI) software. De bepaling van de aviditeit met de molecuulmassa van 22 kDa die overeenkomt met een rhGH molecuul gekozen. De detectiegrenzen werden voor de drie studies met Excel.

Discussion

Onregelmatige niveaus van hGH, een natuurlijk hormoon, zijn gekoppeld aan talrijke medische aandoeningen die menselijke groei en ontwikkeling beïnvloeden. Bovendien is exogene toediening van rhGH gewoonlijk door atleten, ook al is verboden, als dopingmiddel om hun prestaties te verbeteren. Uitdagingen in het opsporen van rhGH misbruik gevolg van de moeilijkheden bij het onderscheiden van exogeen hGH van endogene vorm. Als zodanig, de huidige goedgekeurde techniek voor het detecteren van exogeen hGH berust op het meten van de verhouding van de 22 kDa isoform hGH ten opzichte van het 20 kDa isoform. Omdat de isovorm-test eisen voor het meten van meerdere hGH isovormen gelijktijdig binnen een korte periode in een breed bereik van concentraties, dus we beschouwd als de SPRI platform als een perfecte match. Bovendien endogene hGH niveau schommelen tot een zeer laag niveau (0,03 ng / ml) in bloed daarom detectiesysteem moet kunnen onze comfortabel meten high specificity. Daardoor ook onderzocht in deze studie het potentieel van Nano-SPRI als een diagnostisch hulpmiddel voor hGH en vergeleken direct bij de le en de klassieke ELISA immunoassay.

Gebaseerd op resultaten van deze studie, het belangrijkste voordeel van de SPRI and Nano-SPRI methode is dat rhGH-concentraties worden gemeten op een snellere wijze in vergelijking met de meer conventionele methode ELISA. Een standaard tijdsduur voor het meten van rhGH niveaus in een monster met de directe detectiewerkwijze werd 1 uur terwijl de Nano-lent vereist 2 uur door de extra stappen in het proces. Overall, met SPRI en Nano-SPRI experimenten, voor de injectie van een monster, een kalibratie-stap wordt sterk aanbevolen. Bovendien, de injectie van een ruw monster, zoals menselijk serum resulteert in enige niet-specifieke interacties als gevolg is het noodzakelijk om een ​​hoog zoutgehalte wasbuffer injecteren alleen onthullen specifieke interacties. Het is ook vermeldenswaard dat een wasbeurt stap is absoluut noodzakelijkna de invoering van het blokkeren van moleculen aan het sensoroppervlak, ongebonden moleculen te verwijderen. Wat ELISA tijd eisen veel groter (~ 16-18 uur) voor de analyse van een monster. Een langere incubatietijd nodig is de gevoeligheid van de assay speciaal is verbeterd voor dit onderzoek de focus te vergelijken met de detectielimiet.

De keuze van de oppervlakte chemie zal variëren van de ene toepassing naar de andere en dit kan worden gerealiseerd als een van de beperking van de SPRI techniek. In deze studie, uiteenlopende en combinatie van chemische linkers en blokkering moleculen werden beoordeeld om de juiste combinatie om een ​​optimale binding efficiëntie van rhGH waarnemen om de sensor oppervlak te verkrijgen. Bijvoorbeeld, in deze studie, de combinatie van BSA en PEG goed geserveerd bij het minimaliseren van niet-specifieke interacties. In een eerdere studie 17, waarbij de vangligand was aptameren, PEG alleen diende als de beste blokkerende molecuul. De variabelendie van invloed bindingsefficiëntie analyt ligand zijn ook afhankelijk van de pH, buffer en temperatuur. Daarom is met elke toepassing, moeten deze variabelen worden geoptimaliseerd. Bovendien is het essentieel om de optimale spotten concentratie van het ligand aan het chip oppervlak te bepalen. Een titratie experiment met een reeks concentraties van geïmmobiliseerde liganden wordt uitgevoerd alvorens de studie. Als voor ELISA, een cruciale stap in de procedure voor de wasbuffer uit putten decanteren van de microplaat aanboren dit gegarandeerd geen overblijvende vloeistof is overgebleven. Het verwijderen van de buffer wassen met pipet niet voldoende was als enige overgebleven vloeistof bemoeid met het signaal lezing van de doelgroep monster.

Met betrekking tot gevoeligheid, ELISA (1 ng / ml) is vergelijkbaar met lent (3,61 ng / ml), maar nano-lent (9,20 pg / ml) verbetert de gevoeligheid van drie ordes van grootte, waardoor het mogelijk metingen bij lagere biologische niveaus van rhGH 0,03 ng / ml. Zoals we eerder gemeld 16,17, de verbetering van het signaal bijgebracht door de NanoEnhancers wordt toegeschreven aan een massa laden effect en de sterke koppeling die bestaat tussen NIR fluoroforen en uitdragen oppervlakteplasmonen voor goud film nanostructuren. Hoewel, Nano-SPRI voegt een extra stap om de procedure, kan dit niveau van de gevoeligheid van de toepassingen van SPRI technologie in verschillende verkooppunten te verbreden.

Spri biedt wetenschappers een volledige kinetisch profiel (K D, K a en K d) van antilichaam / rhGH interactie terwijl ELISA alleen affiniteit waarden kunnen melden. De variatiecoëfficiënt (CV) was beneden 10% van de lent (4,1%) en ELISA (6,5%), wat suggereert goede reproduceerbaarheid. De ELISA en SPRI affiniteitswaarden zijn verschillend omdat de invangantilichamen geïmmobiliseerd op de sensor chip verschillen van antilichamen geïmmobiliseerd op de ELISA plaat met 96 putjes. Wat Nano-SPRI een hogere CV-waarde (20%) waargenomen. Er zijn een aantal parameters die kunnen bijdragen als bron van errors voor CV bepalen. Bijvoorbeeld, de Nano-lent experiment een veel lagere concentratie van de stof wordt gemeten, de toevoeging van NanoEnhancers voegt een stap in de procedure en het experiment werd handmatig uitgevoerd. Een zeer goede correlatie tussen Nano-lent en ELISA werd bereikt voor de detectie van rhGH in spiked humaan serum. Tenslotte kan een ELISA-techniek betrouwbaar maar de methode zelf is tijdrovend, waardoor het moeilijk te gebruiken in situaties waarin real time monitoring en multiplexing, zoals het geval is met hGH zijn. Bovendien, een aantrekkelijke eigenschap die niet direct in deze studie die lent biedt via ELISA onderzocht, is de mogelijkheid om honderden interacties meet gelijktijdig in real time. Daarom is in de toekomst, zullen Nano-lent methode worden geëvalueerd om meerdere biomarkers tegelijkertijd direct (multiplexing) aanwezig in serum bij verschillende concentraties detectie van zijn potentieel als een levensvatbare klinische diagnose-instrument onderzocht.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NanoManufacturing Innovation Consortium for funding support.

Materials

Somatotropin Growth Hormone (GH1) capture antibody  Acris Antibodies DM1015
Bovine Serum Albumin  Fisher Bioreagents  BP671-10
Biotin labeled Somatotropin Growth Hormone (GH1) detection antibody  Acris Antibodies AM09304BT-N
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide  TCI America D1601
Ethanolamine Acros Organics  141-43-5
Ethanol Fisher Chemicals   BP2818-4
Human HGH ELISA Kit  invitrogen  KAQ1081
Human Serum  Sigma Aldrich  H4522  
Rabbit IgG Antibody  Sigma Aldrich  I5006
11-mercaptoundecanoic acid  Sigma Aldrich  450561
Nanostrip  Cyantek 
N-hydroxysuccinimide  Sigma Aldrich  130672
Phosphate Buffer Saline Invitrogen  00-3002
Polyethylene glycol (800 Da)  Sigma Aldrich  729108
Recombinant Human Growth Hormone  Calbiochem 869008
Sodium Acetate Sigma Aldrich  127-09-3
Sodium Chloride  Fisher Chemicals   7647-14-5
Streptavidin coated near infrared quantum dots  Life Technologies  Q10171MP
UV/Ozone Procleaner Bioforce Nanosciences 
Microwave reactor   CEM Corporation Discover system 
SPRi-Arrayer   LabNext Xactll Microarray System 
SPR biochip HORIBA 
SPRi-Lab+ HORIBA
Synergy Mx Multimode Microplate reader  BioTek 
ScrubberGen HORIBA Data Analysis software 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Popii, V., Baumann, G. Laboratory measurement of growth hormone. Clinica Chimica Acta. 350 (1-2), 1-16 (2004).
  2. Higham, C. E., Trainer, P. J. Growth hormone excess and the development of growth hormone receptor antagonists. Exp Physiol. 93 (11), 1157-1169 (2008).
  3. Sönksen, P., Salomon, F., Cuneo, R. Metabolic effects of hypopituitarism and acromegaly. Horm Res. 36, 27-31 (1991).
  4. Molitch, M., et al. Evaluation and Treatment of Adult Growth Hormone Deficiency: An Endocrine Society Clinical Practice Guideline. J Clin Endocrinol Metab. 91 (5), 1621-1634 (2006).
  5. . . The World Anti-Doping Code: The 2015 Prohibited List International Standard. , (2015).
  6. . . The 2014 prohibited list world anti-doping code. , (2014).
  7. Langkamp, M., Weber, K., Ranke, M. B. Human growth hormone measurement by means of a sensitive ELISA of whole blood spots on filter paper. Growth Horm IGF Res. 18 (6), 526-532 (2008).
  8. Rich, R. L., Myszka, D. G. Survey of the year 2007 commercial optical biosensor literature. J Mol Recognit. 21 (6), 355-400 (2008).
  9. Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal Bioanal Chem. 377 (3), 528-539 (2003).
  10. Hoa, X. D., Kirk, A. G., Tabrizian, M. Toward Integrated Surface Plasmon Resonance Biosensors: A Review of Recent Progress. Biosens Bioelectron. 23 (2), 151-160 (2007).
  11. de Juan-Franco, E., Rodrìguez-Frade, J. M., Mellado, M., Lechuga, L. M. Implementation of a SPR immunosensor for the simultaneous detection of the 22K and 20K hGH isoforms in human serum samples. Talanta. 114, 268-275 (2013).
  12. de Juan-Franco, E., Caruz, A., Pedrajas, J. R., Lechuga, L. M. Site-directed antibody immobilization using a protein A-gold binding domain fusion protein for enhanced SPR immunosensing. Analyst. 138 (7), 2023-2031 (2013).
  13. Du, H., et al. Immunological screening and characterization of highly specific monoclonal antibodies against 20 kDa hGH. Bioanalysis. 4 (17), 2161-2168 (2012).
  14. Treviño, J., Calle, A., Rodrìguez-Frade, J. M., Mellado, M., Lechuga, L. M. Surface plasmon resonance immunoassay analysis of pituitary hormones in urine and serum samples. Clin Chim Acta. 403 (1-2), 56-62 (2009).
  15. Wu, Z., Bidlingmaier, M., Dall, R., Strasburger, C. J. Detection of doping with human growth hormone. Lancet. 353 (9156), 895 (1999).
  16. Malic, L., Sandros, M. G., Tabrizian, M. Designed biointerface using near-infrared quantum dots for ultrasensitive surface plasmon resonance imaging biosensors. Anal. Chem. 83 (13), 5222-5229 (2011).
  17. Vance, S. A., Sandros, M. G. Zeptomole Detection of C-Reactive Protein in Serum by a Nanoparticle Amplified Surface Plasmon Resonance Imaging Aptasensor. Sci. Rep. 4 (5129), 1-7 (2014).
  18. Uludag, Y., Tothill, I. E. Cancer biomarker detection in serum samples using surface plasmon resonance and quartz crystal microbalance sensors with nanoparticle signal amplification. Anal. Chem. 84 (14), 5898-5904 (2012).
  19. Špringer, T., Homola, J. Biofunctionalized gold nanoparticles for SPR-biosensor-based detection of CEA in blood plasma. Anal Bioanal Chem. 404 (10), 2869-2875 (2012).

Tags

SPRiNano-SPRiELISAHGHSerumBiomarker DetectionLabel-freeReal-time MonitoringBiochip Surface Chemistry11-mercaptoundecanoic Acid1-Ethyl-3-carbodiimideN-Hydroxysuccinimide

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Vance, S., Zeidan, E., Henrich, V. C., Sandros, M. G. Comparative Analysis of Human Growth Hormone in Serum Using SPRi, Nano-SPRi and ELISA Assays. J. Vis. Exp. (107), e53508, doi:10.3791/53508 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image