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Biology

Analisi comparativa di ormone umano della crescita nel siero Utilizzando SPRI, Nano-SPRI e saggi ELISA

Published: January 07, 2016
doi:
10.3791/53508
, , ,
1Department of Nanoscience,University of North Carolina at Greensboro, 2Center for Biotechnology, Genomics, and Health Research,University of North Carolina at Greensboro, 3HORIBA Scientific

Summary

Il lavoro proposto valuta il potenziale diagnostico di superficie per immagini risonanza plasmonica diretto e amplificato (SPRI) saggi, in particolare per l'individuazione di ormone della crescita umano ricombinante nel siero umano a spillo, confrontando SPRI risultati direttamente con disponibile in commercio saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) kit.

Abstract

Metodi sensibili e selettivi per l'individuazione di ormone della crescita umano (hGH) su una vasta gamma di concentrazioni (alti livelli di 50-100 ng ml – 1 e livelli minimi di 0,03 ng ml – 1) nel sangue circolante sono essenziali come livelli variabili possono indicare la fisiologia alterata. Ad esempio, disturbi della crescita che si verificano durante l'infanzia può essere diagnosticata misurando i livelli di hGH nel sangue. Inoltre, l'uso improprio di ricombinante hGH nello sport non solo pone una questione etica presenta anche gravi minacce per la salute di chi abusa. Una strategia popolare per misurare hGH uso improprio, si basa sulla rilevazione del rapporto di 22 kDa hGH a totale hGH, come livelli endogeni non 22 kDa goccia dopo esogeno ricombinante hGH (rhGH) amministrazione. Risonanza plasmonica di superficie di imaging (SPRI) è uno strumento analitico che consente il monitoraggio diretto (senza etichetta) e la visualizzazione delle interazioni biomolecolari registrando cambiamenti del ind rifrazioneex adiacente alla superficie del sensore in tempo reale. Al contrario, il metodo colorimetrico più utilizzato, saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) utilizza anticorpi di rilevamento marcato con un enzima per misurare indirettamente concentrazione dell'analita dopo l'aggiunta di un substrato che induce un cambiamento di colore. Per aumentare la sensibilità di rilevamento, amplificato SPRI utilizza un formato dosaggio panino e vicino infrarosso (punti quantici QDs) per aumentare la potenza del segnale. Dopo il riconoscimento diretta SPRI di ricombinante rhGH nel siero umano a spillo, il segnale SPRI è amplificata dalla iniezione sequenziale di anticorpi rilevazione rivestito con QD nel vicino infrarosso (Nano-SPRI). In questo studio, il potenziale diagnostico di SPRI diretta e amplificato è stata valutata per la misurazione rhGH spillo nel siero umano e confrontato direttamente con le funzionalità di un kit ELISA disponibile in commercio.

Introduction

Ormone della crescita (hGH) è un peptide di 191 aminoacidi (22 kDa) prodotto dalla ghiandola pituitaria e direttamente rilasciato nel flusso sanguigno. Le interazioni tra la crescita peptide-ormone di rilascio ipotalamico (GHRH) e somatotropina inducono secrezioni pulsatili di hGH. Di conseguenza, i livelli di hGH variano da alti nelle 50-100 ng / ml ai minimi nell'intervallo 0,03 ng / ml 1. Deficit o eccesso di hGH nel corpo possono provocare una vasta gamma di sintomi fisiologici anormali. Ad esempio, i livelli eccessivi di hGH può portare a gigantismo 2 e 3 del diabete. Livelli impoverito di hGH causano zucchero nel sangue nei neonati, e la densità ossea debole e la depressione negli adulti 4.

L'amministrazione della forma ricombinante di hGH (rhGH) migliora la massa muscolare magra, riducendo il grasso corporeo. In quanto tale, questa sostanza è diventato il farmaco di scelta per gli atleti professionisti e dilettanti in quanto migliora la forza fisica che conferisce un advantage a competizioni sportive. rhGH è vietato dall'Agenzia mondiale antidoping (WADA) 5,6 e molto impegno da parte di ricercatori internazionali si è focalizzata sullo sviluppo di test in grado di rilevare la presenza o l'effetto anabolizzante.

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) è il metodo preferito per la determinazione di hGH in sangue intero 7. Sebbene, ELISA è una tecnica affidabile che offre buona sensibilità e selettività, è relativamente tempo e di manodopera. Inoltre, ELISA si basa sul rilevamento indiretto di hGH impiegando tag enzimatici. In contrasto, risonanza plasmonica superficiale (SPR) permette di riconoscere hGH direttamente senza l'uso di etichette in tempo reale. Il principio di rilevamento dietro SPR coinvolge una superficie di rilevamento costituito da un prisma che è rivestito con uno strato sottile di metallo (oro o argento); quando una luce polarizzata monocromatica interagisce con la superficie metallica, si generano "plasmoni di superficie". Il legame di un analitaad un recettore di superficie immobilizzato sulla superficie metallica perturba le condizioni di risonanza con conseguente tuffo risonanza spostata, che possono poi essere correlata alla concentrazione dell'analita. Biosensori basati su SPR sono ora disponibili in commercio che offrono in tempo reale, etichetta tecnica libera per monitorare gli eventi biomolecolari vincolanti e reazioni biochimiche 8-10. Più recentemente, SPRI stato sviluppato in risposta alla necessità di multiplexing (cioè, il monitoraggio di più eventi di legame contemporaneamente), che non era possibile in biosensori SPR classici. Così, SPRI è emerso come uno strumento per monitorare più eventi contemporaneamente vincolanti. Sistemi spri attuali si basano su immagini microscopiche di una superficie che viene eccitato con luce ad un angolo e lunghezza d'onda 10 specifico. L'immagine viene poi catturato su un dispositivo (CCD) array di accoppiamento di carica.

Ad oggi, ci sono stati alcuni test basati su SPR sviluppati per rilevare hGH 11-14. Una strategia particolare, Conosciuto come metodo isoforma 15, si basa sulla rilevazione del rapporto di 22 kDa hGH sul totale hGH, come livelli endogeni non-22-kDa goccia dopo somministrazione esogena rhGH. Recentemente, de Juan-Franco et al. 11 riferito sullo sviluppo di un immunosensor basato SPR per il rilevamento selettivo del 22 kDa e 20 kDa isoforme hGH in campioni di siero umano. Gli anticorpi monoclonali specifici per ciascuna isoforma stati immobilizzati direttamente sul sensore oro permettendo la misurazione di entrambe le isoforme simultaneamente in una singola iniezione con un limite di rilevazione a 0,9 ng ml -1. In alternativa, SPR è stato utilizzato per lo screening anticorpi con alta specificità per hGH 13. Se la concentrazione dell'analita bersaglio scende sotto il limite della SPRI sistema di rilevazione (<nM), si deve ricorrere ad amplificare il segnale SPRI tramite l'utilizzo di nanoparticelle (Nano-SPRI). Tale amplificazione basato su SPR è stato ben documentato in letteratura 16-19 per vtipi arie di analiti e superfici.

In questo lavoro, il potenziale analitico di biosensori basati SPRI e Nano-SPRI è stato esaminato, in particolare per il rilevamento di rhGH nel siero umano spillo, e il confronto della sua capacità di rilevamento direttamente ELISA. I seguenti parametri saranno rivisti e considerati: tempo di rilevamento, la sensibilità, profilo cinetico, riproducibilità e specificità.

Protocol

1. preparazione di soluzioni e di proteine ​​campioni per Spri Preparare 100 ml di soluzione di sale basso tampone fosfato salino (PBS) contenente fosfato 10 mM, 150 mM di cloruro di sodio e pH 7,4. Preparare 50 ml di soluzione di PBS contenente fosfato salino elevato 10 mM, 750 mM di cloruro di sodio e pH 7,4. Preparare 5 ml di 10 mM acetato di sodio. Preparare uno stock di 5 mg / ml di albumina sierica bovina (BSA) diluita in basso contenuto di sale soluzione PBS. Preparare una soluzione stock di ormone della crescita umano ricombinante (rhGH) ad una concentrazione di 1 mg / ml in soluzione di sale basso PBS. Preparare soluzioni di anti-rhGH e anticorpo di controllo negativo ad una concentrazione di 100 ug / ml. 2. Preparare spri Chip Array anticorpi Pulire il chip per sonicazione in 120 ml di soluzione piranha stabilizzata (3: 1 di acido solforico concentrato al 30% di perossido di idrogeno) per 90 min a 50 ° C e seguire risciacquandoe sonicazione con acqua per 5 min. Poi, sciacquare chip con etanolo e asciugare con corrente di azoto. Posizionare il chip dorato in una camera UV / ozono per 30 minuti per rimuovere eventuali contaminanti. Aggiungere 150 mg di acido 11-mercaptoundecanoic a 20 ml di etanolo in una provetta contenente una barra agitatrice e un tappo della provetta. Posizionare chip provetta e microonde tubo / chip 50 W e 50 ° C per 5 min. Sciacquare chip con etanolo e immergere in etanolo per 5 min. Seguite da un risciacquo con acqua e immergere in acqua per 5 minuti. Aggiungere 150 mg di 1-etil-3- (3-dimetilamminopropil) carbodiimmide a 20 ml di acqua in una provetta contenente una barra agitatrice e un tappo della provetta. Forno a microonde di chip come al punto 2.4. Risciacquare chip con acqua e immergere in acqua per 5 minuti. Aggiungere 150 mg di N-idrossisuccinimmide in 20 ml di acqua in una provetta contenente una barra agitatrice e un tappo della provetta. Forno a microonde di chip come al punto 2.4. Risciacquare chip con acqua e immergere in acqua per 5 minuti. Prepare 250 pM polietilene glicole (PEG, 800 Da) in 20 ml di acqua in una provetta contenente una barra agitatrice e un tappo della provetta. Forno a microonde di chip come al punto 2.4. Nota: Microwaving PEG800 sulla superficie del sensore viene eseguita come una fase di blocco per impedire il legame non specifico di proteine ​​del siero e complessi quantum dot poi utilizzato nell'esperimento. Ciò si ottiene PEG800 reagire con non occupati siti nudo oro sul chip. Risciacquare chip con acqua e immergere in acqua per 5 minuti. Preparare 15 ug / ml di soluzione di anticorpo anti-rhGH e soluzione di controllo negativo di anti-immunoglobulina G (anti-IgG) e aggiungere 10 ml di ogni soluzione di anticorpi di un pozzo nel piatto ben 384. Progettare il modello macchia nella microarrayer (4 x 7 quadranti per ogni campione) e il chip posto con anticorpi con un Teflon 500 micron capovolto pin. Incubare Chip spotted per 2 ore a temperatura ambiente e in atmosfera umida di 75% o superiore. Sciacquare e immergere in acqua per circuito integrato5 minuti. Poi, circuito integrato a secco con corrente di azoto. 3. SPRI dell'esperimento e blocco Inizializzare lo strumento e selezionare directory. Selezionare vera fotocamera tempo e avviare la pompa a siringa a 1 ml / min per 10 ml di acqua degasata. Inserire circuito integrato nello strumento e tenere iniezione di acqua fino a quando tutte le bolle vengono rimosse. Dopo aver sciacquato chip con 10 ml di acqua, avviare l'acquisizione delle immagini, e seguire passando il buffer di basso contenuto di sale PBS e farlo girare a 1 ml / min per 5 ml e portata poi rallentare a 20 l / min per 20 min . Selezionare l'immagine altamente contrastata, che mostra gli anticorpi immobilizzati avvistati sul chip. Selezionare e definire i 400 micron singoli spot circolari corrispondenti alle anticorpi immobilizzati. Dopo lo strumento traccia le curve plasmon, scegliere un angolo di lavoro che ha la più alta pista nelle curve di riflettività. Flusso un tampone di corsa a 20 ml / min di basse salt PBS attraverso il sistema finché il segnale da tutti i luoghi selezionati stabilizza. Caricare il BSA (100 mcg / ml) in tampone di corsa nel loop del campione (150 microlitri) con la valvola di iniezione in posizione di carico. Poi commutare la valvola nella posizione di iniezione per iniettare la soluzione alla cella di flusso. Nota: BSA viene iniettato per legare covalentemente alla superficie reattiva ammina, il restante non legato BSA lavare la superficie attraverso buffer di risciacquo. Iniettare 150 ml di una soluzione di 10 mM acetato di sodio sulla superficie e seguire da una iniezione di 150 microlitri di sale PBS. Iniettare 150 ml di etanolammina (1 mM) per disattivare la superficie reattiva ammina. Iniettare 150 ml di 10 mM acetato di sodio per lavare la superficie. Quindi, passare il tampone di corsa di PBS con 50 ug / ml BSA ad un flusso di 250 ml / min per un totale di 5 ml. Nota: 50 mg / ml BSA viene aggiunto al tampone di corsa per il blocco addizionale del surfaccia per non covalente occupando i siti non-specifici e questo viene fatto per ridurre ulteriormente il legame non specifico di proteine ​​del siero alla superficie. Cambia portata a 5 ml / min e lasciarlo stabilizzare per 20 min. 4. SPRI Rilevamento di ormone umano della crescita Preparare una soluzione di una concentrazione insieme di rhGH (30.000 pg / ml; 250 pg / ml; 25 pg / mL; 2,5 pg / ml e 0,25 pg / ml) nel siero 10% e diluito in PBS contenente 1 mg / ml BSA. Preparare un 2: soluzione di 1 con l'aggiunta di 1 ml di biotina marcati anticorpi di rilevamento anti-rhGH (6 micron) a 3 ml di streptavidina rivestite vicino punti quantici infrarossi (1 micron) in una provetta da 0,5 ml microcentrifuga e incubare per 30 minuti per l'accoppiamento efficace . Iniettare 150 microlitri della soluzione di hGH spillo siero umano nel ciclo di iniezione. Ciò si traduce in un forte aumento del segnale seguito da un calo lento dal siero non specificatamente legato risciacquo della superficie. Una volta che il segnoal stabilizza, lavare la superficie con una soluzione di 450 mM di cloruro di sodio aggiunto al tampone di corsa. Diluire la soluzione di anticorpi anti-rilevamento rHGH e punti quantici ad una concentrazione di 10 nM (2: 1) con tampone di corsa (PBS con 50 mg / ml BSA) e iniettare nella cella di flusso. 5. spri Analisi dei dati Nota: Dopo l'iniezione del rhGH spillo siero umano e quantum dot enhancer, un aumento della variazione riflettanza avviene a causa dello spostamento amplificato delle curve plasmoni. Il risultato un'immagine differenza che mostra un'immagine in scala di grigi correlare al segnale del sul chip. Importare i dati in un programma di analisi dei dati. Tracciare il segnale SPRI (% riflettività) in funzione del tempo (s) e determinare la differenza tra l'anti-rhGH e macchie di anticorpi di controllo negativi dopo il lavaggio di sale. 6. ELISA Protocollo (1 ° giorno) Conservare tutti i componenti del dosaggio compresi in il kit ELISA rhGH a 2-8 ° C. Ciò include l'anticorpo anti-rhGH piastre rivestite e, standard (0-5) nel siero di pecora, i controlli (1 e 2) nel siero umano, tampone di coniugato, (200x) tampone di lavaggio, cromogeno TMB (tetrametilbenzidina) e smettere di reagente. Setup i reagenti e seguono i metodi descritti nel protocollo del kit ELISA commerciali. In primo luogo, lasciare che l'anticorpo anti-rhGH rivestito 96-pozzetti riscaldare a TA prima di aprire la confezione di alluminio. Quindi rimuovere il numero desiderato di strisce a 8 pozzetti per il dosaggio e richiudere la busta chiusa contenente i restanti pozzi e conservare a 2-8 ° C. Preparare standard mediante ricostituzione in 2 ml di acqua distillata per serie # 0, in 1 ml di acqua distillata per gli standard (1-5), in 1 ml di acqua distillata per i controlli (1 e 2). Di seguito una tabella dei corrispondenti concentrazioni degli standard e dei controlli (Tabella 1): <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-con-next.within-page = "always"> Standards Concentrazione (ng / ml) 0 0 1 0.17 2 0.94 3 2.63 4 10.4 5 26.9 Controllo N ° 1 1,22 ± 0,33 ng / ml Control # 2 4,97 ± 1,25 ng / ml Tabella 1. Concentrazioni delle norme e dei controlli inclusi nel kit ELISA commerciale. Preparare i campioni che consistono dell'ormone rhGH nel siero umano 10% per le seguenti concentrazioni (Tabella 2): <strong> di esempio Concentrazione (ng / ml) 1 0,025 2 0.2 3 0.5 4 2.5 5 10 6 30 Tabella 2. Le concentrazioni dei campioni rhGH preparati nel 10% siero. Aggiungere 50 ml di ogni standard, controllo e campione in ciascun pozzetto (in triplicato). Sigillare i pozzetti e incubare con gli standard, controlli e campioni rhGH O / N a 4 ° C sotto un leggero scuotimento. 7. ELISA Protocol (2 ° giorno) Rimuovere la piastra da shaker e lasciarlo riscaldare per RT (15-20 minuti) prima di procedere con il test. Rimuovere Anti-rhGH-HRP, tampone coniugato, tampone di lavaggio (200x), cromogeno TMB (tetrametilbenzidina), und reagente fermata dal frigorifero e lasciare il riscaldamento a RT. Preparazione dei reagenti: (secondo le specifiche del produttore) Diluire Anti-rhGH-HRP 40x con il tampone coniugato. Preparare il tampone di lavaggio diluendo 200x con acqua distillata. Aggiungere 50 ml di coniugato anti-rhGH-HRP in ogni pozzetto, sigillare i pozzetti ed incubare a temperatura ambiente per 30 minuti mentre scuotendo delicatamente. Decantare la soluzione dai pozzetti e capovolgere la piastra e picchiettare asciutto su una carta assorbente. Quindi aggiungere 200 ml di tampone di lavaggio in ogni pozzetto. Decantare la soluzione di lavaggio e rubinetto a secco su un tessuto assorbente. Ripetere questa operazione per 3 volte. Aggiungere 100 ml di Cromogeno in tutti i pozzetti entro 15 minuti dopo la fase di lavaggio. Incubare per 30 minuti a RT al buio, mentre scuotendo delicatamente. Le soluzioni si rivolgono da incolore a blu. Aggiungere 100 ml di reagente bloccante in ogni pozzetto. Le soluzioni si rivolgono dal blu al giallo. Immediatamente, th leggeree assorbanza di ciascun pozzetto a 450 nm usando un lettore di micropiastre. Tracciare la curva standard per le norme previste (0-5). Poi tracciare la densità ottica del 10% rhGH in campioni di siero ottenuti alla concentrazione di ogni campione.

Representative Results

Le prestazioni di SPRI e Nano-SPRI (SPRI impiegando le NanoEnhancers) è stato confrontato con ELISA per la rivelazione di rhGH in un ambiente complesso. Le differenze nella configurazione di questi metodi sono descritte brevemente. Per SPRI (rilevazione diretta, figura 1), l'anticorpo di cattura è immobilizzato sulla superficie e quindi il campione viene iniettato e vincolante di analita alla superficie del sensore è misurata direttamente in tempo reale e modo senza etichetta. Tuttavia, con Nano-SPRI (Figura 1), dopo l'analita lega alla superficie del sensore, una iniezione consecutiva è seguita con punti quantici rivestite con anticorpi di rilevamento per amplificare il segnale SPRI. Figura 1. Una rappresentazione schematica a confronto in modalità diretta (SPRI) e modalità amplificata (Nano-SPRI) di rilevazione di rhGH in c leganti (rhGH o IgG anticorpi specifici) maleducati campioni. sono stati immobilizzati in un formato array sul biochip SPRI. Proteina bersaglio (rhGH) spillo nel siero umano introdotto alla superficie del sensore sono direttamente rilevati (SPRI) e in sequenza evidenziata con NanoEnhancers (Nano-SPRI). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Come per ELISA, le piastre a pozzetti multipli arrivano già pre-funzionalizzati con anticorpo di cattura e poi campione viene introdotto, l'analita di interesse si legano. Un anticorpo di rilevazione è introdotta seguita da aggiunta del substrato. La densità ottica viene quindi misurata a 450 nm. In questo studio, un kit ELISA commerciale (Figura 2) è stato utilizzato per misurare rhGH spillo nel siero umano 10%. 8 / 53508fig2.jpg "/> Figura 2. Una rappresentazione schematica della procedura di saggio ELISA. proteine ​​rhGH (ovali blu) è introdotto per i pozzi che sono stati pre-funzionalizzati con anticorpi monoclonali (giallo) specifici per rhGH. Interazioni non specifiche vengono eliminati sciacquando i pozzetti con tampone di lavaggio, seguito dall'introduzione di un anticorpo di rilevazione prefunctionalized con perossidasi di rafano (HRP, viola). La soluzione cambia colore dopo l'aggiunta del substrato tetrametilbenzidina (TMB, oro). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3 rappresenta la curva di titolazione di rhGH spillo nel siero umano al 10% ed è tracciata contro la DO ottenute a 450 nm. Una buona risposta lineare è stata osservata e il limite di rilevazione è stato determinato in 1 ng / ml. Il coefficiente di variation (CV) è stato del 6,5% che suggerisce una buona riproducibilità. Figura 3. ELISA analisi dei dati. La concentrazione di rhGH spillo nel siero è tramato contro il DO ottenute a 450 nm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Avanti, l'individuazione di rhGH spillo nel siero umano è stata valutata con SPRI. Rilevamento diretto di rhGH portato con la curva concentrazione gradiente corrispondente (figura 4), ​​ciascun punto rappresenta il valore medio della differenza riflettività calcolata da tre curve cinetiche SPRI per ciascuna concentrazione. Il limite di rilevazione (LOD) è stato determinato in 3,61 ng / ml. Il test di rilevazione diretta SPRI era altamente riproducibile come il CV del testera solo 4,1%. Figura 4. diretto SPRI rilevamento di hGH spillo nel siero umano al 10%. La normalizzato trama cinetica risultante SPRI dopo l'iniezione di varie quantità di hGH spillo nel siero umano, seguito dall'iniezione di un buffer di sale (linea verticale tratteggiata) per rimuovere non Interazioni specifico d'. Una curva gradiente di concentrazione che rappresenta il legame di varie quantità di hGH spillo nel siero umano per la superficie del sensore che è stata prefunctionalized con biotinilato specifico-hGH-anticorpo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Per aumentare la sensibilità del biosensore SPRI, NanoEnhancers (QD pre-funzionalizzati con anticorpi di rilevamento) sono in sequenza introdotti alla superficie del sensore al fine di evidenziare la presenza di rhGH spillo nel siero umano. Dopo sottrazione del fondo, i NanoEnhancers sono stati in grado di amplificare la risposta biosensore fino al 7,9%, comunque, con il minimo cambio di segnale (Immunoglobulina G (IgG) anticorpi specific, variazione 0,38% a riflettività; Figura 5 a regioni controllate di interesse Imaging. la superficie del sensore ha rivelato che solo le regioni di interesse che hanno gli anticorpi rhGH-specifici immobilizzati esperienza il più grande cambiamento di contrasto corroborare direttamente con la risposta sensorgram cinetica. Figura 5. Rilevamento di rhGH usando un test panino spillo nel siero umano 10%. SPRI trama cinetica dopo l'iniezione di rhGH (30 ng / ml) in tampone (PBS 10 mM, 150 mM di cloruro di sodio, pH = 7,4) su un pre Chip -functionalized con acido 11-mercaptoundecanoic / rhGH-anticorpo specifico e controllo IgG-anticorpi poi bloccato con BSA, seguito dall'aggiunta di rilevamento di anticorpi rivestite punti quantici (NanoEnhancers). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Per dimostrare la praticabilità del biosensore Nano-SPRI, è stato valutato il campo di misura di rhGH in campioni grezzi. Un intervallo di lavoro esteso da 30.000 pg / ml a 0,25 pg / ml determinato come risposta all'aggiunta di NanoEnhancers (figura 6). Vale la pena notare che ogni punto sulla curva di titolazione è mediata da tre esperimenti indipendenti. Di conseguenza, il limite inferiore di rilevamento è stata calcolata in 9,20 pg / ml e il coefficiente di variazione è stata del 20%. Figura 6.Nano-SPRI rilevamento di hGH spillo nel siero umano. Normalizzato SPRI rappresentazione trama cinetica del segnale hGH_specific_Anti-QD-amplificata per campioni di siero umano a spillo con diverse concentrazioni di hGH. Una linea verticale tratteggiata (grigio) rappresenta il punto di iniezione del tampone di corsa. (b) Una curva gradiente di concentrazione rappresenta il legame di NanoEnhancers (hGH_specific_Anti-QD) dopo l'iniezione di varie quantità di hGH spillo nel siero umano sulla superficie del sensore che è stato prefunctionalized con anticorpi acido 11-mercaptoundecanoic / hGH-specifico. Cliccando qui per vedere una versione più grande di questa figura. Successivamente, il cambiamento che avviene nella curva riflettività SPR in funzione della concentrazione è stata confrontata tra diretto e metodo del saggio biologico NanoEnhancer (Figura 7). Per la de direttaTecnica protezione tra il 25 e 0,25 pg / ml, il segnale ha iniziato a plateau e questo non è sorprendente in quanto queste concentrazioni sono inferiori al LOD di 3 ng / ml (Figura 7). Allo stesso modo, per la tecnica amplificato, concentrazioni al di sotto del LOD di segnale di 9,2 pg / ml hanno iniziato a plateau e ha mostrato praticamente nessuna variazione. Figura 7. Un'analisi comparativa di SPRI con Nano-SPRI. Questo grafico a barre rappresenta la variazione percentuale riflettività (% R) dopo l'introduzione di rhGH spillo nel siero umano (rilevazione diretta) seguito dal iniezione di NanoEnhancers (rilevamento amplificato) per 30.000 pg / ml, 250 pg / ml, 25 pg / ml, 2,5 pg / ml e 0,25 pg / ml. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-pagina = "1"> Inoltre, è stata valutata la specificità del biosensore Nano-SPRI. Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) spillo nel siero umano è stato iniettato come controllo poiché hGH stimola la secrezione di IGF-1 attraverso il recettore dell'ormone della crescita sulla membrana degli epatociti. Dopo l'iniezione del IGF-1 nel siero, i NanoEnhancers stati iniettati in sequenza e la risposta del segnale SPR non hanno mostrato alcun legame specifico (Figura 8). Tuttavia, quando rhGH spillo nel campione di siero è stato iniettato allo stesso punto funzionalizzati con anticorpi rhGH, è stato osservato il miglioramento del segnale. In conclusione, la piattaforma Nano-SPRI ha dimostrato eccellenti specificità e selettività per rhGH. Figura 8. Valutazione della Nano-SPRI selettività verso rhGH. La risposta biosensore Nano-SPRI dopo l'iniezione di rhGH (nero) e di IGF-1 (rossa) in ssiero carpiato. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Un'analisi di correlazione è stata eseguita utilizzando il coefficiente di correlazione di Pearson per determinare la correlazione tra l'intensità del segnale SPRI e valori di densità ottica ELISA (Figura 9). A p-value <0.01 è stato considerato significativo. Come illustrato in questo grafico, vi è una buona correlazione tra i livelli nel siero umano rHGH spillo misurati mediante SPRI ed ELISA. Il valore di R è stato 0,9263 per 9 diversi campioni. Figura 9. Pearson analisi di correlazione tra il ELISA e Nano-SPRI. La trama è correlato intensità del segnale Nano-SPRI (asse y) con densità ottica ELISA (asse x) valori. (Pearsil coefficiente di correlazione n = 9, r = 0,9263, p = 0,00000183). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. La costante di equilibrio di dissociazione (K D) è stato determinato utilizzando il software GraphPad per ELISA. Il valore calcolato K D è stato di circa 79 nM (Tabella 3). Gli su (K a) e off (K d) i tassi non è stato possibile determinare con metodo ELISA. Tuttavia, utilizzando il software di analisi dei dati, il metodo di rilevazione diretta ha portato con K valore D di 23 pM utilizzando la massa molecolare di 22 kDa che corrisponde a una molecola rhGH. L'on e off tassi sono stati calcolati per essere 6.1 x10 7 M -1 s -1 e 1,33 x 10 -3 sec -1, rispettivamente. Questo si traduce per sé che il 0,13% del rhGH e complessi anticorpo decadimento al secondo. Come per l'unaesperimento spri mplified, una interazione globale più forte è stata osservata tra NanoEnhancers e rhGH come l'affinità di legame calcolato è stato determinato per essere 4:03. Inoltre, un tasso di associazione più forte è stata osservata per NanoEnhancers e rhGH di anticorpo di cattura / rhGH, tuttavia il tasso di dissociazione suggerisce che il 0,26% del NanoEnhancer / rhGH / Cattura anticorpo decadimento al secondo. Metodo K D (affinità) K un (tasso on-) K d (off-rate) LOD ELISA 79.45 x 10 -9 M N / A N / A 1 ng / ml Spri 23.2 x 10 -12 M 6.1 x 10 7 M -1 s -1 <td> 1.33 x10 -3 sec -1 3.61 ng / ml Nano-SPRI 4.33 x 10 -12 M 7.54 x10 8 M -1 sec -1 2.62 x10 -3 sec -1 0,0092 ng / ml Tabella 3. Completa l'analisi dei dati cinetica. Valutazione della affinità, on-rate e off-rate delle risposte anticorpali utilizzando GraphPad (ELISA) e l'analisi dei dati del software (SPRI e Nano-SPRI). La determinazione della avidità utilizzando la massa molecolare di 22 kDa che corrisponde ad una molecola rhGH stata scelta. I limiti di rilevamento sono stati determinati per tutti e tre gli studi che utilizzano Excel.

Discussion

Livelli irregolari di hGH, un ormone naturale, sono state collegate a numerosi disturbi medici che influenzano la crescita e lo sviluppo umano. Inoltre, la somministrazione esogena di rhGH è comunemente usato dagli atleti, anche se è proibito, come agente doping per migliorare le loro prestazioni. Sfide nella rilevazione rhGH risultato improprio dalla difficoltà nel distinguere esogeno hGH dalla forma endogena. Come tale, la tecnica attuale, approvato per rilevare hGH esogena si basa sulla misurazione del rapporto tra il 22 kDa isoforma hGH in relazione al 20 kDa isoforma. Poiché le richieste di prova per la misurazione isoforma di molteplici isoforme hGH contemporaneamente entro un breve periodo di tempo in un ampio intervallo di concentrazioni, di conseguenza, abbiamo considerato la piattaforma SPRI come una corrispondenza perfetta. Inoltre, il livello di hGH endogeno fluttuare un livello molto basso (0,03 ng / ml) nel sangue quindi il sistema di rivelazione deve essere in grado di misurare questa gamma comodamente con alta specificity. Come risultato, abbiamo anche indagato in questo studio il potenziale di Nano-SPRI come strumento diagnostico per hGH e confrontato direttamente con SPRI e la immunologico classica ELISA.

Sulla base dei risultati ottenuti da questo studio, il vantaggio principale del metodo SPRI e Nano-SPRI è che le concentrazioni rHGH possono essere misurati in maniera più rapida rispetto al metodo più convenzionale ELISA. Una durata standard per la misurazione dei livelli di rhGH in un campione con il metodo di rilevazione diretto è stato di 1 ora, mentre il Nano-SPRI richiesto 2 ore a causa delle ulteriori passi nel processo. Nel complesso, con SPRI e Nano-SPRI esperimenti, prima dell'iniezione di un campione, una fase di calibrazione è altamente raccomandato. Inoltre, l'iniezione di un campione grezzo come risultati di siero umano in alcune interazioni non specifiche di conseguenza è indispensabile per iniettare un buffer di lavaggio elevata sale per rivelare solo interazioni specifiche. È anche interessante notare che una fase di lavaggio è assolutamente necessariodopo l'introduzione di bloccare molecole sulla superficie del sensore, per rimuovere le molecole non legate. Per quanto riguarda i requisiti di tempo ELISA sono molto maggiore (~ 16-18 hr) per l'analisi di un campione. È necessario un tempo di incubazione più come la sensibilità del test è migliorata appositamente per questo studio, come il focus era di confrontare il limite inferiore di rilevamento.

La scelta della chimica superficiale varia da un'applicazione all'altra e questo potrebbe essere realizzato come una limitazione della tecnica SPRI. In questo studio, una vasta gamma e combinazione di linkers chimici e molecole di blocco sono stati valutati per ottenere la giusta combinazione per osservare ottimale efficienza vincolante rhGH sulla superficie del sensore. Ad esempio, in questo studio, la combinazione di BSA e PEG servito bene a minimizzare le interazioni non specifiche. Tuttavia, in un precedente studio 17, in cui il ligando di cattura era un aptameri, PEG solo servito come il migliore molecola di blocco. Le variabiliche l'efficienza sul legame di analita ligando sono anche dipende dal pH, tampone e temperatura. Pertanto, con qualsiasi applicazione, queste variabili devono essere ottimizzate. Inoltre, è fondamentale per determinare la concentrazione ottimale individuazione del ligando alla superficie del chip. Un esperimento di titolazione con un intervallo di concentrazioni di ligandi immobilizzati viene eseguita prima di iniziare lo studio. Per quanto riguarda ELISA, un passo cruciale nella procedura era di decantare il tampone di lavaggio dai pozzetti battendo la micropiastra come questo garantito nessun liquido residuo è rimasto. Rimozione del tampone di lavaggio con pipetta non era sufficiente come qualsiasi liquido residuo interferiva con la lettura del campione mirato segnale.

In riferimento alla sensibilità, ELISA (1 ng / ml) è paragonabile a SPRI (3.61 ng / ml), ma nano-SPRI (9,20 pg / ml) migliora la sensibilità di tre ordini di grandezza, consentendo misure ai livelli biologici inferiori di rhGH 0,03 ng / ml. Come abbiamo riportato in precedenza 16,17, il potenziamento del segnale impartita dal NanoEnhancers è attribuita a un effetto di carico di massa e il forte accoppiamento che esiste tra fluorophores NIR e propagano plasmoni di superficie per nanostrutture pellicola d'oro. Anche se, Nano-SPRI aggiunge un passo in più per la procedura, questo livello di sensibilità può ampliare le applicazioni della tecnologia SPRI in vari punti vendita.

Spri fornisce agli scienziati un profilo cinetico completo (K D, K e un K d) di anticorpo interazione / rhGH mentre ELISA può riportare solo i valori di affinità. Il coefficiente di variazione (CV) era inferiore al 10% per SPRI (4,1%) ed ELISA (6,5%), suggerendo buona riproducibilità. I valori di affinità ELISA e SPRI sono diversi perché gli anticorpi di cattura immobilizzati sul chip sensore sono diversi da anticorpi immobilizzati nella piastra a 96 pozzetti ELISA. Quanto Nano-SPRI è stato osservato un valore CV elevato (20%). Ci sono diversi parametri che possono contribuire come fonte di errors per la determinazione CV. Ad esempio, con l'esperimento Nano-SPRI una concentrazione molto bassa di analita viene misurato, l'aggiunta di NanoEnhancers aggiunge un altro passo della procedura e l'esperimento è stato eseguito manualmente. Un molto buona correlazione tra Nano-SPRI ed ELISA è stato raggiunto per il rilevamento di rhGH in siero umano a spillo. Infine, ELISA può essere una tecnica affidabile tuttavia il metodo stesso richiede tempo che rende difficile l'uso in situazioni che richiedono il monitoraggio in tempo reale e multiplexing, come è il caso con hGH. Inoltre, una caratteristica più interessante che non esaminato direttamente in questo studio che SPRI offre oltre ELISA, è la capacità di misurare centinaia di interazioni simultaneamente in tempo reale. Pertanto in futuro, metodo Nano-SPRI sarà valutato per rilevare molteplici biomarker simultaneamente in tempo reale (multiplazione) presenti nel siero a varie concentrazioni per esaminare il suo potenziale come strumento diagnostico clinica valida.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NanoManufacturing Innovation Consortium for funding support.

Materials

Somatotropin Growth Hormone (GH1) capture antibody  Acris Antibodies DM1015
Bovine Serum Albumin  Fisher Bioreagents  BP671-10
Biotin labeled Somatotropin Growth Hormone (GH1) detection antibody  Acris Antibodies AM09304BT-N
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide  TCI America D1601
Ethanolamine Acros Organics  141-43-5
Ethanol Fisher Chemicals   BP2818-4
Human HGH ELISA Kit  invitrogen  KAQ1081
Human Serum  Sigma Aldrich  H4522  
Rabbit IgG Antibody  Sigma Aldrich  I5006
11-mercaptoundecanoic acid  Sigma Aldrich  450561
Nanostrip  Cyantek 
N-hydroxysuccinimide  Sigma Aldrich  130672
Phosphate Buffer Saline Invitrogen  00-3002
Polyethylene glycol (800 Da)  Sigma Aldrich  729108
Recombinant Human Growth Hormone  Calbiochem 869008
Sodium Acetate Sigma Aldrich  127-09-3
Sodium Chloride  Fisher Chemicals   7647-14-5
Streptavidin coated near infrared quantum dots  Life Technologies  Q10171MP
UV/Ozone Procleaner Bioforce Nanosciences 
Microwave reactor   CEM Corporation Discover system 
SPRi-Arrayer   LabNext Xactll Microarray System 
SPR biochip HORIBA 
SPRi-Lab+ HORIBA
Synergy Mx Multimode Microplate reader  BioTek 
ScrubberGen HORIBA Data Analysis software 
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Vance, S., Zeidan, E., Henrich, V. C., Sandros, M. G. Comparative Analysis of Human Growth Hormone in Serum Using SPRi, Nano-SPRi and ELISA Assays. J. Vis. Exp. (107), e53508, doi:10.3791/53508 (2016).
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