可溶性タバコの煙抽出物によって損傷した後のマウス間葉系幹細胞の移動の変化を検出するために創傷スクラッチアッセイの最適化

細胞移動は、組織開発、修理、再生、ならびにがんの転移や動脈硬化^1と病理学的過程として多くの生理学的プロセスに非常に協調的かつ不可欠です。細胞遊走の理解は、損傷を受けた組織を修復し、細胞移植技術と^{2グラフト}人工組織などの病理学的状態を治療するために使用される新規治療薬に特に関連します。厳密に、定量化適応可能で、かつコスト効率が重要であるアッセイを用いてこれらの細胞の遊走能を定量化する、組織修復^{3の媒介における}間葉系間質細胞（MSC）の役割現在の関心を考えます。重要なことは、このようなアッセイは、損傷後の細胞遊走能が比較的微妙な変化を検出するのに十分な感度でなければなりません。スクラッチアッセイ、トランスウェル遊走アッセイ（ボイデンCH含む細胞遊走を定量するための現在の方法は、琥珀）、マイクロピラーアレイ、および細胞排他ゾーンアッセイは再現性、カスタマイズ、定量化、および費用対効果^1,4,5の制限の範囲を有します。ここで説明する最適化されたスクラッチアッセイは堅牢な成果、定量化、および画像ベースの解析機能、費用対効果、および他のアプリケーションへの適応性を示しています。

スクラッチアッセイは、種々の実験条件⁵下で細胞の遊走および増殖を評価するために、複数の容量で使用されてきました。アッセイは、またはそれに近い合流を完了するためにそれらを成長、指定された細胞を播種し、滅菌針またはピペットチップ⁶と、得られた単層を傷つけ伴います。分析は、最も一般的に、ランダムに選択された位置^7-9における複数の時点にわたるスクラッチの幅を比較することによって行われます。その顕著な使用にもかかわらず、スクラッチアッセイは、再現性と定量化の問題によって混乱されます。変動でスクラッチの発生だけでなく、細胞の微小環境を変化させるだけでなく、プレート表面とその下の細胞外マトリックス^{5を損傷する}ことによって細胞遊走を阻害することができます。アッセイは、しばしば12時間に7にわたって実施されている、しかし、より遅い移行と長い分析時間を表示する細胞株について、増殖が交絡変数^7,10になります。最後に、スクラッチ・プロセスによって生成された老化細胞は、単層^1のギャップを埋めるために必要な細胞外シグナル伝達を妨害因子を放出することができます。スクラッチアッセイの最適化は、アッセイ時間の長さを最小にし、操作中の望ましくない細胞死を防止、表面特性を妨害しない一貫したギャップの生成を必要とします。ストッパーベースのアッセイは、細胞の除外ゾーンアッセイの最適化です。このアッセイは、細胞増殖を除外ウェルの中央に配置されたストッパを利用するが、細胞が中央排除区域の周囲にメッキされることを可能にします。移行を評価するために、ストッパーを除去し、得られた排他ゾーンは、移行が発生するための表面を提供します。しかし、このアッセイは^{、10のカスタマイズ}又は適合させることが困難であり、いくつかの用途のために、この技術はまた、法外な費用がかかることができます。

スクラッチアッセイおよびその誘導体、トランスウェル遊走アッセイ（またはボイデンチャンバーアッセイ）とは対照的に走化性剤^{8,11を含む}チャンバ内に、微孔性ろ過膜を介して、一方のチャンバから移動する細胞の数を定量化することによって、マイグレーションを評価します^{、 12。}多孔質膜を介した移行後、細胞は走化性薬剤に暴露された膜面に付着し、正確に定量化することは難しいことができますので、この技術は、MSCのような接着細胞のための有用性を制限しています。アッセイは、いくつかの三次元の移動パターンを検査することができるが、制限された細胞型はれる正確細胞移動の制限その有用性を定量化することができ^、10。スクラッチアッセイの別の方法としては、変形し、代理として配列中に移行する細胞の能力を用いて3次元空間を介して細胞運動性を測定したマイクロピラーアレイを使用しています。 Polydimethlysiloxane（PDMS）エラストマーは、精密金型の上に硬化させ、オゾンで処理し、フィブロネクチンは、均質で非分解性微小環境を生成します。 ^アレイ 4 ^{を入力する}細胞の能力を測定するために、必要に応じてマイクロピラーの間隔も変化させることができます。金型は、高アスペクト比の^アレイ 13の負のバージョンを作成するために、シリコンウエハの深い反応性イオンエッチングを使用して作成されます。アッセイは、そのカスタマイズによって強化されている間、移動細胞の直接可視化を介して三次元の移行、および分析をモデル化する能力は、マイクロピラーのアレイを作成する際の難しさは、経済的にその普及を妨げます。

このプロトコルで説明最適化されたスクラッチアッセイは、効率的な、COSを提供自由に利用可能なソフトウェアを用いて分析することができる一貫した傷を製造するためのT-有効な方法。代わりに、細胞移動の前後にスクラッチを介して行われる単純な幅の測定、ソフトウェアは、移行前と後の合計スクラッチ領域を決定することを可能にします。この進歩は、傷が幅測定が行われるべき場所を決定しようとしているの発行を制限し、傷の幅はそれの長さに沿って均一であるかどうか。また、細胞数、細胞の種類と合流し、細胞にダメージの程度の注意深い最適化がさらに分析を最適化するために議論されています。