Summary

可溶性タバコの煙抽出物によって損傷した後のマウス間葉系幹細胞の移動の変化を検出するために創傷スクラッチアッセイの最適化

Published: December 03, 2015
doi:

Summary

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

Abstract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

Introduction

細胞移動は、組織開発、修理、再生、ならびにがんの転移や動脈硬化1と病理学的過程として多くの生理学的プロセスに非常に協調的かつ不可欠です。細胞遊走の理解は、損傷を受けた組織を修復し、細胞移植技術と2グラフト人工組織などの病理学的状態を治療するために使用される新規治療薬に特に関連します。厳密に、定量化適応可能で、かつコスト効率が重要であるアッセイを用いてこれらの細胞の遊走能を定量化する、組織修復3の媒介における間葉系間質細胞(MSC)の役割現在の関心を考えます。重要なことは、このようなアッセイは、損傷後の細胞遊走能が比較的微妙な変化を検出するのに十分な感度でなければなりません。スクラッチアッセイ、トランスウェル遊走アッセイ(ボイデンCH含む細胞遊走を定量するための現在の方法は、琥珀)、マイクロピラーアレイ、および細胞排他ゾーンアッセイは再現性、カスタマイズ、定量化、および費用対効果1,4,5の制限の範囲を有します。ここで説明する最適化されたスクラッチアッセイは堅牢な成果、定量化、および画像ベースの解析機能、費用対効果、および他のアプリケーションへの適応性を示しています。

スクラッチアッセイは、種々の実験条件5下で細胞の遊走および増殖を評価するために、複数の容量で使用されてきました。アッセイは、またはそれに近い合流を完了するためにそれらを成長、指定された細胞を播種し、滅菌針またはピペットチップ6と、得られた単層を傷つけ伴います。分析は、最も一般的に、ランダムに選択された位置7-9における複数の時点にわたるスクラッチの幅を比較することによって行われます。その顕著な使用にもかかわらず、スクラッチアッセイは、再現性と定量化の問題によって混乱されます。変動でスクラッチの発生だけでなく、細胞の微小環境を変化させるだけでなく、プレート表面とその下の細胞外マトリックス5を損傷することによって細胞遊走を阻害することができます。アッセイは、しばしば12時間に7にわたって実施されている、しかし、より遅い移行と長い分析時間を表示する細胞株について、増殖が交絡変数7,10になります。最後に、スクラッチ・プロセスによって生成された老化細胞は、単層1のギャップを埋めるために必要な細胞外シグナル伝達を妨害因子を放出することができます。スクラッチアッセイの最適化は、アッセイ時間の長さを最小にし、操作中の望ましくない細胞死を防止、表面特性を妨害しない一貫したギャップの生成を必要とします。ストッパーベースのアッセイは、細胞の除外ゾーンアッセイの最適化です。このアッセイは、細胞増殖を除外ウェルの中央に配置されたストッパを利用するが、細胞が中央排除区域の周囲にメッキされることを可能にします。移行を評価するために、ストッパーを除去し、得られた排他ゾーンは、移行が発生するための表面を提供します。しかし、このアッセイは、10のカスタマイズ又は適合させることが困難であり、いくつかの用途のために、この技術はまた、法外な費用がかかることができます。

スクラッチアッセイおよびその誘導体、トランスウェル遊走アッセイ(またはボイデンチャンバーアッセイ)とは対照的に走化性剤8,11を含むチャンバ内に、微孔性ろ過膜を介して、一方のチャンバから移動する細胞の数を定量化することによって、マイグレーションを評価します、 12。多孔質膜を介した移行後、細胞は走化性薬剤に暴露された膜面に付着し、正確に定量化することは難しいことができますので、この技術は、MSCのような接着細胞のための有用性を制限しています。アッセイは、いくつかの三次元の移動パターンを検査することができるが、制限された細胞型はれる正確細胞移動の制限その有用性を定量化することができ、10。スクラッチアッセイの別の方法としては、変形し、代理として配列中に移行する細胞の能力を用いて3次元空間を介して細胞運動性を測定したマイクロピラーアレイを使用しています。 Polydimethlysiloxane(PDMS)エラストマーは、精密金型の上に硬化させ、オゾンで処理し、フィブロネクチンは、均質で非分解性微小環境を生成します。 アレイ 4 を入力する細胞の能力を測定するために、必要に応じてマイクロピラーの間隔も変化させることができます。金型は、高アスペクト比のアレイ 13の負のバージョンを作成するために、シリコンウエハの深い反応性イオンエッチングを使用して作成されます。アッセイは、そのカスタマイズによって強化されている間、移動細胞の直接可視化を介して三次元の移行、および分析をモデル化する能力は、マイクロピラーのアレイを作成する際の難しさは、経済的にその普及を妨げます。

このプロトコルで説明最適化されたスクラッチアッセイは、効率的な、COSを提供自由に利用可能なソフトウェアを用いて分析することができる一貫した傷を製造するためのT-有効な方法。代わりに、細胞移動の前後にスクラッチを介して行われる単純な幅の測定、ソフトウェアは、移行前と後の合計スクラッチ領域を決定することを可能にします。この進歩は、傷が幅測定が行われるべき場所を決定しようとしているの発行を制限し、傷の幅はそれの長さに沿って均一であるかどうか。また、細胞数、細胞の種類と合流し、細胞にダメージの程度の注意深い最適化がさらに分析を最適化するために議論されています。

Protocol

注:この研究では、遠位の肺組織からの肺の間葉系幹細胞(LR-MSCを)を単離のいずれかの細胞表面マーカーの発現(CD45の陰性 、CD31のNEG、SCA-1高 、のEpCAM NEG)14,15に基づいて、使用していましたアウト・成長16植片、または酵素消化17を使用 。接着LR-MSCは、高グルコース無グルタミン、15%FBS、1×抗生物質/抗真菌剤、および2mMグルタミン(以下、完全?…

Representative Results

ここで提示スクラッチアッセイは、マウスの肺常駐間葉系間質細胞(LR-MSCS)を使用して実施し、プロトコル・ノートで参照として単離しました。 LR-MSCは、60 mmの組織培養皿中の500,000個の細胞の密度で播種し、48時間で90%コンフルエンスまで増殖させました。損傷を生成するために、4%のCSEは、(上述の)初期播種期間後24時間が、スクラッチアッセイの前に細胞とともにインキュベートし?…

Discussion

ここで説明するプロトコルは、スクラッチアッセイを実施し、分析するための定量的堅牢な、標準化された方法を提供します。単純なスクラッチアッセイは日常的に細胞の遊走を調べるために、研究のさまざまな分野で使用されています。しかし、伝統的にスクラッチアッセイは再現7,10の問題につながっている、標準化されたセットアップと定量化プロトコルを欠いていました。ス?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We are grateful to the other members of the lab for their technical assistance in developing the CSE damage assay, and their support and advice during the development of this assay. In addition, we are grateful to the Holy Cross Fenwick Scholar Committee for their support of Nicholas Cormier, and the Holy Cross College Honors program for their support of Alexander Yeo.

Materials

DMEM (high glucose, no added glutamine) Life Technologies 31053-036
Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone Fisher Scientific SH3091002
Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone  Fisher Scientific SV3007901
Glutamine, 200mM, Thermo Scientific HyClone Fisher Scientific SH3003401
TypeLE cell dissociation reagent Life Technologies 12563-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone  Fisher Scientific SH3002802
Falcon standard 60mm tissue culture dishes Fisher Scientific 08-772B
Fisherbrand Sterile 200ul pipet tips Fisher Scientific 02-707-502
Inverted light microscope with camera attachment Variable
ImageJ software  http://imagej.nih.gov/ij/
MRI_Wound_Healting plugin http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool
Statistical analysis software Microsoft Excel

References

  1. Gough, W., Hulkower, K. I., Lynch, R., et al. A quantitative, facile, and high-throughput image-based cell migration method is a robust alternative to the scratch assay. J. Biomol. Screen. 16 (2), 155-163 (2011).
  2. Ridley, A. J., Schwartz, M. A., Burridge, K., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2013).
  3. Sharma, R. R., Pollock, K., Hubel, A., McKenna, D. Mesenchymal stem or stromal cells: a review of clinical applications and manufacturing practices. Transfusion. 54 (5), 1418-1437 (2014).
  4. Booth-Gauthier, E. A., Du, V., Ghibaudo, M., et al. Hutchinson-Gilford progeria syndrome alters nuclear shape and reduces cell motility in three dimensional model substrates. Integr. Biol. (Camb). 5 (3), 569-577 (2013).
  5. Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. Electrical wound-healing assay for cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (6), 1554-1559 (2004).
  6. Pinco, K. A., He, W., Yang, J. T. Alpha4beta1 Integrin Regulates Lamellipodia Protrusion Via a Focal Complex/focal Adhesion-Independent Mechanism. Mol. Biol. Cell. 13 (9), 3203-3217 (2002).
  7. Fronza, M., Heinzmann, B., Hamburger, M., Laufer, S., Merfort, I. Determination of the wound healing effect of Calendula extracts using the scratch assay with 3T3 fibroblasts. J. Ethnopharmacol. 126 (3), 463-467 (2009).
  8. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J. Vis. Exp. (88), (2014).
  9. Walter, M. N., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: an in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Exp. Cell Res. 316 (7), 1271-1281 (2010).
  10. Goetsch, K. P., Niesler, C. U. Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis. Anal. Biochem. 411 (1), 158-160 (2011).
  11. Chung, C. A., Chen, C. Y. The effect of cell sedimentation on measuring chondrocyte population migration using a Boyden chamber. J. Theor. Biol. 261 (4), 610-625 (2009).
  12. Fabbri, M., Bianchi, E., Fumagalli, L., Pardi, R. Regulation of lymphocyte traffic by adhesion molecules. Inflamm. Res. 48 (5), 239-246 (1999).
  13. Saez, A., Ghibaudo, M., Buguin, A., Silberzan, P., Ladoux, B. Rigidity-driven growth and migration of epithelial cells on microstructured anisotropic substrates. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (20), 8281-8286 (2007).
  14. Paxson, J. A., Gruntman, A. M., Davis, A. M., et al. Age Dependence of Lung Mesenchymal Stromal Cell Dynamics Following Pneumonectomy. Stem Cells Dev. 22 (24), 3214-3225 (2013).
  15. McQualter, J. L., Brouard, N., Williams, B., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27 (3), 623-633 (2009).
  16. Hoffman, A. M., Paxson, J. A., Mazan, M. R., et al. Lung-Derived Mesenchymal Stromal Cell Post-Transplantation Survival, Persistence, Paracrine Expression, and Repair of Elastase-Injured Lung. Stem Cells Dev. 20 (10), 1779-1792 (2011).
  17. Beane, O. S., Fonseca, V. C., Cooper, L. L., Koren, G., Darling, E. M. Impact of aging on the regenerative properties of bone marrow-, muscle-, and adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells. PLoS One. 9 (12), e115963 (2014).
  18. Chen, L., Ge, Q., Tjin, G., et al. Effects of cigarette smoke extract on human airway smooth muscle cells in COPD. Eur. Respir. J. 44 (3), 634-646 (2014).
  19. Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods Mol. Biol. 371, 21-31 (2007).

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Cormier, N., Yeo, A., Fiorentino, E., Paxson, J. Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract. J. Vis. Exp. (106), e53414, doi:10.3791/53414 (2015).

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