Yara Scratch Testi optimizasyonu Çözünür Sigara Duman Özü ile Hasar sonrası Fare Mezenkimal Stromal Hücre Göç Değişiklik Algılama
Summary
The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.
Abstract
Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.
Introduction
Hücre göçü, doku gelişimi, onarım ve yenileme, hem de kanser metastazı ve damar sertliği 1 gibi patolojik işlemler gibi birçok fizyolojik süreçte yüksek oranda koordine ve hayati önem taşımaktadır. Hücre göçü bir anlayış hasarlı dokuları tamir ve hücre nakli teknolojileri ve yapay doku 2 aşılama dahil patolojik durumların tedavisinde kullanılan gelişmekte olan tedavilere özellikle önemlidir. , Doku tamirini 3 aracılık titizlikle, ölçülebilir uyarlanabilir ve uygun maliyetli ilgi olduğunu bir deney kullanılarak bu hücrelerin göç kapasitesinin miktarının mezenkimal stromal hücreler (MKH) rolü mevcut ilgi dikkate alındığında. Daha da önemlisi, bu tip bir analiz hücre hasarı sonrası göç kapasitesi nispeten küçük değişiklikleri tespit etmek için yeterince hassas olması gerekir. Çizik deneyleri, trans-kuyu göç deneyleri, hücre göçü miktarının da dahil olmak üzere mevcut metodlar (Boyden chamberleri), micropillar diziler ve hücre yasak bölge tahlilleri tekrarlanabilirlik, customizability, ölçümü ve maliyet etkinliği 1,4,5 sınırlamaları bir dizi sahiptir. Burada anlatılan optimize karalama tahlil sonuçlarını sağlam, ölçülebilir ve görüntü tabanlı analiz yetenekleri, maliyet-etkililik ve diğer uygulamalara uyum gösterir.
Kazı deneyleri, farklı deney koşulları altında 5 hücresi yayılmasını ve çoğalmasını değerlendirmek için çok sayıda kapasitelerde kullanılmıştır. Deney veya yakınındaki izdiham tamamlamak için onlara büyüyen belirlenmiş tohum hücreleri ve steril bir iğne veya bir pipet ucu 6 ile elde edilen tek tabakalı çizilmeye gerektirir. Analiz en çok rastgele seçilmiş yerle 7-9 birden fazla zaman noktası boyunca sıfırdan genişliğini karşılaştırılmasıyla gerçekleştirilir. Onun belirgin kullanılmasına rağmen, çizilmeye tahlil tekrarlanabilirlik ve ölçümü ile ilgili sorunlar ile şaşırmış. Değişkenliğisıfırdan nesil değil, sadece hücrelerin mikro değiştirir, ama aynı zamanda plaka yüzeyi ve altında yatan hücre dışı matriks-5 zarar vererek hücre göçü engelleyebilir. Deneyler genellikle, ancak daha yavaş göç ve daha uzun deney süreleri gösteren hücre hatları için, 12 saat ila 7 üzerinden yürütülmektedir, proliferasyon, bir karıştırıcı bir değişken 7,10 olur. Son olarak, kaşıma işlemi tarafından oluşturulan yaşlanmış hücreler tek tabakalı 1 açığını kapatmak için gerekli dışı sinyalizasyon müdahale faktörleri serbest bırakabilirsiniz. Karalama tahlil Optimize tahlil süresi uzunluğu en aza indirerek, ve manipülasyon sırasında istenmeyen hücre ölümünü engelleyen, yüzey özelliklerine müdahale etmeyen tutarlı bir boşluk yaratılmasını gerektirir. Durdurucu bazlı analiz, bir hücre yasak bölge testinin bir optimizasyon olduğunu. Bu deney, hücre büyümesinin hariç oyuk ortasına yerleştirilen bir stoper kullanılmaktadır ancak bu hücreler, merkezi hariç bırakma bölgesi çevresindeki kaplama sağlar.Göç değerlendirmek için, durdurucu çıkarılmaktadır ve elde edilen dışlama alanı geçiş meydana gelmesi için bir yüzey sağlar. Bununla birlikte, bu deney, özelleştirmek veya 10 adapte zordur ve bazı uygulamalar için, bu teknik, aynı zamanda engelleyici mal olabilir.
Sıfırdan deneyleri ve bunların türevleri, trans-çukurlu göç deneyleri (veya Boyden oda tahlilleri) aksine kemotaktik maddeler 8,11 ihtiva eden bir hazneye, mikro-gözenekli bir filtre zarı içinden bir odacıktan hareket hücre sayısının ölçülmesi ile göç değerlendirmek 12. Gözenekli zarından göç sonrasında, hücreler kemotaktik ajanlara maruz membran tarafına yapışır ve doğru ölçmek için zor olabilir, çünkü bu teknik, MSC gibi yapışık hücreler için programı sınırlıdır. Tahlil bazı üç boyutlu göç yollarını incelemek mümkün olsa da, kısıtlı hücre tipleri hangi için doğru hücre göçü limitini kendi yarar ölçmek mümkün 10. Karalama deneyleri için başka bir alternatif deforme ve bir vekil olarak diziye göç hücrelerinin yeteneği kullanarak üç boyutlu bir uzayda hücresel motilitesini ölçen bir mikro-ayağı dizisi kullanır. Polydimethlysiloxane (PDMS) elastomerler kesin bir kalıp üzerine tedavi ve ozon ile tedavi ve fibronektin homojen olmayan parçalanabilir mikro üretir. Dizi 4 girmek için hücrelerinin yeteneği ölçmek için gerektiği gibi mikro-kolonu boşluk da değişebilir. Kalıp, yüksek boy oranı dizisinin 13 negatif bir sürümünü oluşturmak için silikon gofret derin reaktif iyon aşındırma yoluyla oluşturulur. Tahlil onun customizability tarafından güçlendirilmiştir edilirken, yetenek göç hücrelerinin doğrudan görselleştirme yoluyla üç boyutlu göç ve analiz modeli, mikro-ayağı diziler yaratmada güçlük ekonomik yaygın kullanımını engellemektedir.
Bu protokol açıklanan optimize karalama tahlil verimli, cos sağlarserbestçe kullanılabilir yazılımı kullanılarak analiz edilebilir ve tutarlı bir şekilde çiziklerin üretilmesi için T-etkili bir yöntemdir. Bunun yerine önce ve hücre göçü sonrasında sıfırdan genelinde yapılan basit genişlik ölçümleri, yazılım öncesi ve sonrası toplam çizilmeye göç alanlarını belirlemek için kullanıcı sağlar. Bu gelişme nerede genişlik ölçümleri alınmalıdır çizik belirlemeye çalışıyor konusunu sınırlayan ve sıfırdan genişliği olsun o uzunluğu boyunca üniform olduğunu. Buna ek olarak, hücre sayıları, hücre izdiham tipi ve hücrelere verilen hasarı derecesi dikkatli optimizasyonu daha deneyi optimize etmek için ele alınmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokol gerçekleştirmek ve çizilmeye deneyleri analiz etmek için kantitatif sağlam, standart bir yöntem sağlar. Basit çizik deneyleri rutin hücresel göç incelemek için çalışmanın çok farklı alanlarda kullanılmaktadır. Ancak, geleneksel karalama tahlil tekrarlanabilir 7,10 ile ilgili sorunlar yol açmıştır standart bir set-up ve miktar protokolünü yoksun kalmıştır. Modifikasyonlar ve çizik testi geliştirilmesi için optimizasyonlar birçok bireysel canlı hücr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the other members of the lab for their technical assistance in developing the CSE damage assay, and their support and advice during the development of this assay. In addition, we are grateful to the Holy Cross Fenwick Scholar Committee for their support of Nicholas Cormier, and the Holy Cross College Honors program for their support of Alexander Yeo.
Materials
| DMEM (high glucose, no added glutamine) | Life Technologies | 31053-036 | |
| Fetal Bovine Serum, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3091002 | |
| Antibiotic/antimycotic, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SV3007901 | |
| Glutamine, 200mM, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| TypeLE cell dissociation reagent | Life Technologies | 12563-01 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Thermo Scientific HyClone | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Falcon standard 60mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772B | |
| Fisherbrand Sterile 200ul pipet tips | Fisher Scientific | 02-707-502 | |
| Inverted light microscope with camera attachment | Variable | ||
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| MRI_Wound_Healting plugin | http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Wound_Healing_Tool | ||
| Statistical analysis software | Microsoft Excel |
References
- Gough, W., Hulkower, K. I., Lynch, R., et al. A quantitative, facile, and high-throughput image-based cell migration method is a robust alternative to the scratch assay. J. Biomol. Screen. 16 (2), 155-163 (2011).
- Ridley, A. J., Schwartz, M. A., Burridge, K., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2013).
- Sharma, R. R., Pollock, K., Hubel, A., McKenna, D. Mesenchymal stem or stromal cells: a review of clinical applications and manufacturing practices. Transfusion. 54 (5), 1418-1437 (2014).
- Booth-Gauthier, E. A., Du, V., Ghibaudo, M., et al. Hutchinson-Gilford progeria syndrome alters nuclear shape and reduces cell motility in three dimensional model substrates. Integr. Biol. (Camb). 5 (3), 569-577 (2013).
- Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. Electrical wound-healing assay for cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (6), 1554-1559 (2004).
- Pinco, K. A., He, W., Yang, J. T. Alpha4beta1 Integrin Regulates Lamellipodia Protrusion Via a Focal Complex/focal Adhesion-Independent Mechanism. Mol. Biol. Cell. 13 (9), 3203-3217 (2002).
- Fronza, M., Heinzmann, B., Hamburger, M., Laufer, S., Merfort, I. Determination of the wound healing effect of Calendula extracts using the scratch assay with 3T3 fibroblasts. J. Ethnopharmacol. 126 (3), 463-467 (2009).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Walter, M. N., Wright, K. T., Fuller, H. R., MacNeil, S., Johnson, W. E. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: an in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Exp. Cell Res. 316 (7), 1271-1281 (2010).
- Goetsch, K. P., Niesler, C. U. Optimization of the scratch assay for in vitro skeletal muscle wound healing analysis. Anal. Biochem. 411 (1), 158-160 (2011).
- Chung, C. A., Chen, C. Y. The effect of cell sedimentation on measuring chondrocyte population migration using a Boyden chamber. J. Theor. Biol. 261 (4), 610-625 (2009).
- Fabbri, M., Bianchi, E., Fumagalli, L., Pardi, R. Regulation of lymphocyte traffic by adhesion molecules. Inflamm. Res. 48 (5), 239-246 (1999).
- Saez, A., Ghibaudo, M., Buguin, A., Silberzan, P., Ladoux, B. Rigidity-driven growth and migration of epithelial cells on microstructured anisotropic substrates. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (20), 8281-8286 (2007).
- Paxson, J. A., Gruntman, A. M., Davis, A. M., et al. Age Dependence of Lung Mesenchymal Stromal Cell Dynamics Following Pneumonectomy. Stem Cells Dev. 22 (24), 3214-3225 (2013).
- McQualter, J. L., Brouard, N., Williams, B., et al. Endogenous fibroblastic progenitor cells in the adult mouse lung are highly enriched in the sca-1 positive cell fraction. Stem Cells. 27 (3), 623-633 (2009).
- Hoffman, A. M., Paxson, J. A., Mazan, M. R., et al. Lung-Derived Mesenchymal Stromal Cell Post-Transplantation Survival, Persistence, Paracrine Expression, and Repair of Elastase-Injured Lung. Stem Cells Dev. 20 (10), 1779-1792 (2011).
- Beane, O. S., Fonseca, V. C., Cooper, L. L., Koren, G., Darling, E. M. Impact of aging on the regenerative properties of bone marrow-, muscle-, and adipose-derived mesenchymal stem/stromal cells. PLoS One. 9 (12), e115963 (2014).
- Chen, L., Ge, Q., Tjin, G., et al. Effects of cigarette smoke extract on human airway smooth muscle cells in COPD. Eur. Respir. J. 44 (3), 634-646 (2014).
- Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods Mol. Biol. 371, 21-31 (2007).
