Otimização do Ensaio Wound zero para detectar mudanças na Murino estromais mesenquimais migração celular após a lesão por Extract fumo do cigarro Solúvel

A migração celular é altamente coordenada e vital para muitos processos fisiológicos, tais como desenvolvimento do tecido, reparação e regeneração, bem como processos patológicos tais como a metástase do cancro e arteriosclerose ^1. Uma compreensão da migração celular é particularmente relevante para as terapias emergentes utilizadas para reparar tecidos danificados e tratar condições patológicas, incluindo as tecnologias de transplante de células e tecidos artificial enxerto ^2. Dado o interesse atual no papel de células estromais mesenquimais (MSCs) na mediação de reparação de tecidos ^3, quantificando a capacidade migratória destas células usando um ensaio que é rigorosamente quantificável, adaptável e relação custo-benefício é de interesse. É importante ressaltar que tal ensaio deve ser suficientemente sensível para detectar mudanças relativamente sutis na capacidade migratória celular após dano. Os métodos actuais para quantificar a migração de células, incluindo ensaios de risco, os ensaios de migração trans-poços (CH Boydenâmbares), matrizes micropillar e ensaios zona de exclusão de células possuem uma série de limitações na reprodutibilidade, personalização, quantificação e custo-efetividade ^1,4,5. O ensaio zero otimizado aqui descrito demonstra resultados robustos, capacidade de análise quantificáveis ​​e baseados em imagem, relação custo-eficácia e capacidade de adaptação a outras aplicações.

Os ensaios de raspadinhas têm sido utilizados em várias capacidades para avaliar a migração celular e proliferação em diferentes condições experimentais ^5. O ensaio implica semeando as células designadas, cultivá-las para completar ou próximo da confluência, e coçar a monocamada resultante com uma agulha estéril ou ponta de pipeta ^6. Análise é mais vulgarmente efectuada por comparação da largura do zero ao longo de múltiplos pontos de tempo em locais seleccionados aleatoriamente ^7-9. Apesar de seu uso proeminente, o ensaio do zero é confundida por problemas com a reprodutibilidade e quantificação. A variabilidade nageração de zero a não apenas altera o microambiente das células, mas também pode impedir a migração de células ao danificar a superfície da placa e da matriz extracelular subjacente ^5. Os ensaios são frequentemente realizados ao longo de 7 a 12 h, no entanto, para linhas de células exibindo migração mais lenta e os tempos de ensaio mais longos, a proliferação torna-se uma variável de confusão ^7,10. Por último, as células senescentes gerados pelo processo de coçar pode libertar factores que interferem com a sinalização extracelular necessária para fechar a fenda na monocamada ^1. Optimizar a zero ensaio requer a criação de uma diferença consistente, que não interfere com as propriedades de superfície, minimizando o comprimento de tempo de ensaio, e a prevenção da morte de células indesejáveis ​​durante a manipulação. O ensaio à base de batente consiste numa optimização do ensaio de uma zona de exclusão de células. Este ensaio utiliza uma rolha colocado no meio do poço que exclui o crescimento celular, mas permite que as células a ser revestida em volta da zona de exclusão central.Para avaliar a migração, a tampa é removida, e a zona de exclusão resultante proporciona uma superfície para a migração ocorra. No entanto, este ensaio é difícil para personalizar ou adaptar a ¹⁰ e para algumas aplicações, esta técnica também pode ser um custo proibitivo.

Em contraste com os ensaios de zero e os seus derivados, ensaios de trans-migração bem (ou ensaios de câmara de Boyden) avaliar a migração através da quantificação do número de células que se movem de uma câmara, através de um filtro de membrana microporosa, para uma câmara contendo agentes quimiotácticos ^{8,11, 12.} Esta técnica tem utilidade limitada para as células aderentes como as MSCs porque após a migração através da membrana porosa, as células aderem ao lado da membrana exposta aos agentes quimiotácticos, e pode ser difícil de quantificar com precisão. Enquanto o ensaio é capaz de analisar alguns padrões de migração tridimensionais, os tipos de células restritas para o qual é capaz de quantificar com precisão limite de migração celular sua utilidade ¹⁰. Outra alternativa para ensaios de zero usa uma rede de micro-pilar, que mede a motilidade celular através de um espaço tridimensional utilizando a capacidade das células para se deformar e migram para a matriz como um substituto. Polydimethlysiloxane (PDMS) elastómeros curados sobre um molde preciso e tratada com ozono e fibronectina produz um microambiente homogénea e não degradável. Espaçamento Micro-pilar também pode ser variado conforme necessário para avaliar a capacidade das células para introduzir a matriz ^4. O molde é criado por meio de gravura de ião reactivo profundo de bolachas de silício para criar uma versão da matriz negativa de alta relação de aspecto ^13. Enquanto o ensaio é reforçada pela sua capacidade de personalização, capacidade de modelar a migração tridimensional, e análise através da visualização direta de células que migram, dificuldade em criar micro-pilar matrizes impede economicamente seu uso generalizado.

O ensaio zero otimizado descrito neste protocolo oferece uma eficiente, cosmétodo t-eficaz para produzir arranhões consistentes que podem ser analisados ​​usando o software disponível gratuitamente. Em vez de medidas de largura simples, feitas em toda a zero antes e depois da migração celular, o software permite ao usuário determinar áreas totais scratch antes e depois da migração. Este avanço limita a questão de tentar determinar onde a zero as medidas de largura devem ser tomadas, e se a largura do zero é uniforme ao longo dela de comprimento. Além disso, a optimização cuidadosa dos números de células, confluência celular e o tipo e grau do dano infligido nas células é discutida, a fim de optimizar ainda mais o ensaio.