Optimalisatie van de wond Scratch Assay om veranderingen in muizen mesenchymale Stromal Cell Migratie Detect Na Schade door Oplosbare sigarettenrook Extract

Celmigratie is sterk gecoördineerde en essentieel voor vele fysiologische processen zoals weefselontwikkeling, herstel en regeneratie, alsook pathologische processen zoals kanker metastase en arteriosclerose ^1. Inzicht in celmigratie is bijzonder relevant voor nieuwe therapieën gebruikt om beschadigde weefsels te herstellen en te behandelen pathologische aandoeningen, waaronder celtransplantatie technologieën en kunstmatige weefsel enten ^2. Gezien de huidige interesse in de rol van mesenchymale stromale cellen (MSC's) bij het ​​mediëren van weefselherstel ^3, kwantificeren het trekkende vermogen van deze cellen met behulp van een test die is rigoureus kwantificeerbaar, flexibele en kosteneffectieve van belang. Belangrijk is dat dergelijke test voldoende gevoelig relatief subtiele veranderingen in de cellulaire trekkende capaciteit sporen na schade. De huidige methoden voor het kwantificeren van cel migratie, waaronder scratch assays, trans-en migratie assays (Boyden chAmbers), micropillar arrays, en mobiele uitsluiting zone assays beschikken over een reeks van beperkingen in de reproduceerbaarheid, aanpasbaarheid, kwantificering en kosten-effectiviteit ^1,4,5. De geoptimaliseerde scratch test hier beschreven toont robuuste resultaten, meetbare en image-based analysemogelijkheden, kosteneffectiviteit en aanpassingsvermogen aan andere toepassingen.

Scratch assays werden gebruikt in verschillende capaciteiten voor celmigratie en proliferatie onder verschillende experimentele condities ⁵ evalueren. De bepaling houdt in het enten van de aangewezen cellen groeien ze of nabij confluentie voltooien en krassen op de resulterende monolaag met een steriele naald of een pipet tip ^6. Analyse wordt meestal uitgevoerd door vergelijking van de breedte van de kras over meerdere tijdstippen op willekeurig gekozen plaatsen ^7-9. Ondanks zijn prominente gebruik wordt de scratch test verstoord door problemen met reproduceerbaarheid en kwantificering. Variabiliteit ingenereren van de kras niet alleen verandert de micro-omgeving van de cellen, maar ook celmigratie belemmeren door beschadiging van het plaatoppervlak en de onderliggende extracellulaire matrix ^5. Assays worden vaak uitgevoerd in 7-12 uur, maar voor cellijnen weergeven langzamere migratie en langere testtijden, proliferatie wordt een verstorende variabele ^7,10. Ten slotte kan verouderde cellen gegenereerd door het krassen procesfactoren die interfereren met de extracellulaire signalering nodig is om het verschil in de monolaag ¹ vrijgeven. Het optimaliseren van de scratch test vereist creëren van een consistente kloof die niet interfereert met de oppervlakte-eigenschappen, het minimaliseren assay tijdsduur en het voorkomen van ongewenste celdood tijdens de manipulatie. De stop gebaseerde test is een optimalisatie van een cel verboden zone assay. Deze test maakt gebruik van een stop in het midden van de put die celgroei uitsluit, maar laat de cellen worden geplateerd om de centrale verboden zone.Om migratie te beoordelen, wordt de stop verwijderd, en de daaruit voortvloeiende uitsluiting zone biedt een oppervlak voor de migratie te voorkomen. Echter, deze test moeilijk te passen of aan te passen ¹⁰ en voor sommige toepassingen, kan deze techniek ook hoge kosten.

In tegenstelling tot nul assays en derivaten daarvan, trans-well migratie assays (of Boyden kamer assays) beoordelen migratie door het kwantificeren van het aantal cellen die van de ene kamer door een microporeus filter membraan, in een kamer die chemotactische ^{8,11, 12.} Deze techniek heeft nut beperkt hechtende cellen zoals MSCs omdat na migratie door het poreuze membraan, de cellen hechten aan de membraanzijde blootgesteld aan de chemotactische middelen en kan moeilijk nauwkeurig te kwantificeren. Terwijl de test is in staat om een driedimensionale migratiepatronen onderzoeken de beperkte cel typen waarvoor zij kan celmigratie grens zijn nut nauwkeurig kwantificeren ¹⁰. Een ander alternatief nul assays maakt gebruik van een micro-pijlers array, die cellulaire motiliteit gemeten door een driedimensionale ruimte met behulp van het vermogen van cellen te vervormen en migreren in de array als een surrogaat. Polydimethlysiloxane (PDMS) elastomeren genezen over een precieze vorm en behandeld met ozon en fibronectine produceert een homogene en niet-afbreekbare micro-omgeving. Afstand micro-pijlers kan ook worden gevarieerd als nodig is om het vermogen van cellen om de matrix ⁴ voer te meten. De mal wordt gecreëerd door diepe reactief ion etsen van siliciumschijven een negatieve versie van de high-aspect-ratio-array ¹³ te creëren. Terwijl de test wordt versterkt door de aanpasbaarheid, vermogen modelleren driedimensionale migratie en analyse door directe visualisatie van migrerende cellen, moeilijk maken micro-pijlers arrays economisch belemmert het wijdverbreide gebruik.

De geoptimaliseerde scratch test beschreven in dit protocol zorgt voor een efficiënte, cost-effectieve methode voor het produceren van consistente krassen die kunnen worden geanalyseerd met vrij beschikbare software. In plaats van eenvoudige breedte metingen over de scratch voor en na celmigratie, de software stelt de gebruiker in staat om totale scratch gebieden te bepalen vóór en na de migratie. Deze vooruitgang beperkt de kwestie van het proberen om te bepalen waar de kras de breedte metingen moeten worden genomen, en of de breedte van de kras is uniform langs zijn totale lengte. Bovendien is een zorgvuldige optimalisatie van celaantallen, celconfluentie en het type en de mate van schade toegebracht aan de cellen behandeld om verdere optimalisatie van de assay.